賀 睿，唐 翠，印春華

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

口服給藥具有使用方便、患者順應(yīng)性良好、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，是一種優(yōu)選的給藥方式［1－2］.然而，常用的抗腫瘤化療藥物多屬于生物藥劑學(xué)分類中的Ⅳ類藥物（低溶解度、低滲透性藥物），諸多問(wèn)題限制其口服使用［3］.紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一種有效的廣譜抗腫瘤藥物，對(duì)乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞性腫瘤等多種實(shí)體瘤具有顯著的療效.但PTX 溶解度低，小腸滲透性差，易受到腸上皮細(xì)胞表面P－糖蛋白（Pgp）介導(dǎo)的藥物外排及細(xì)胞色素P450依賴的藥物代謝，口服生物利用度小于10%［1，4］.為解決上述問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了多種藥物遞送系統(tǒng)以提高PTX 的口服生物利用度，其中可自組裝的聚合物－藥物連接物因其可改善難溶性藥物的溶解度、控制藥物釋放、通過(guò)口服生理屏障等優(yōu)點(diǎn)而引起廣泛關(guān)注［2，4－5］.陽(yáng)離子聚合物殼聚糖季銨鹽（N－Trimethyl Chitosan，TMC）生理?xiàng)l件下溶解性好，黏膜黏附性強(qiáng)，可促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，是一種優(yōu)良的口服遞送載體材料.Yin等［6］研究表明分子質(zhì)量為30ku和200ku，季銨化度為30%的TMC可顯著提高胰島素的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而實(shí)現(xiàn)其有效口服遞送.另外，TMC 含有活性氨基基團(tuán)，可作為藥物的連接位點(diǎn)，制得聚合物－藥物連接物.

本文結(jié)合了TMC及聚合物－藥物連接物的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)并制備了TMC－PTX 納米粒（TP NPs），用于口服遞送PTX.制備分子質(zhì)量分別為30ku和200ku，季銨化度為30%的TMC，以琥珀酸為連接基團(tuán)共價(jià)連接TMC和PTX，制得聚合物－藥物連接物TP，TP在水中可自組裝形成TP NPs.研究TP NPs的理化性質(zhì)、載藥與釋藥、黏膜黏附和促滲透作用.

1 方 法

1.1 材料和動(dòng)物

殼聚糖，脫乙酰度85%，分子質(zhì)量分別為30ku和200ku，購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司；PTX 購(gòu)自四川西昌制藥廠；1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司；N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司；羅丹明B（RhB）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.SD 大鼠，雄性，體重（200±20）g，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.2 TP的制備與表征

參照文獻(xiàn)［7］方法制備琥珀酰PTX（PTX－suc）.參照Yin 等［6］方法，以30ku 和200ku 殼聚糖制備TMC.稱取PTX－suc、NHS和EDC·HCl至高型稱量瓶，PTX－suc∶NHS∶EDC·HCl摩爾比為1∶5∶5，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解，PTX－suc濃度為1mg／mL，攪拌1h；加入10mg／mL TMC 水溶液，PTX－suc與TMC質(zhì)量比為1∶5，攪拌12h；以水透析3d（MWCO 3 500u），冷凍干燥.產(chǎn)物以TP（x）命名，其中x 表示殼聚糖分子質(zhì)量（ku）.

以氘水為TMC的溶劑，氘水、氘代DMSO 和氘代三氟乙酸混合液為TP的溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，AVANCE DMX500型核磁共振儀常溫測(cè)定樣品的核磁共振（1H NMR）圖譜.

1.3 粒徑、Zeta電勢(shì)及形態(tài)

兩親性TP分散于水中可自組裝形成TP納米粒（TP NPs），Zetasizer Nano－ZS型電位及粒度測(cè)定儀測(cè)定TP NPs的粒徑和Zeta電勢(shì).取TP NPs溶液，滴至云母片上，室溫自然干燥，黏于銅臺(tái)，噴金，掃描電鏡（SEM）觀察其形態(tài).

1.4 臨界膠束濃度（CMC）

配制1mg／mL TP NPs溶液，稀釋至不同濃度（0.001～0.4mg／mL）.量取10μL芘的甲醇溶液（6.0×10－4mol／L），置10mL試管中，吹干.分別量取1mL 上述不同濃度的TP NPs溶液，加至吹干的試管中，超聲1h.發(fā)射波長(zhǎng)為390nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品激發(fā)光譜.以激發(fā)波長(zhǎng)為335nm 和333nm 處熒光強(qiáng)度的比值I335／I333對(duì)lg［C／（mg·mL－1）］作圖，計(jì)算TP NPs的CMC.

1.5 載藥量和體外釋放

參照文獻(xiàn)［8］方法，精密稱取1mg PTX，置10mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制得100μg／mL PTX 甲醇溶液；分別精密量取0.2，0.4，0.6，1，1.5，2mL，置10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得濃度分別為2，4，6，10，15，20μg／mL的PTX 標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定227nm 處吸光值，以吸光值對(duì)PTX 濃度進(jìn)行線性回歸，制得PTX 標(biāo)準(zhǔn)曲線.配制100μg／mL TP，測(cè)定227nm 處吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載藥量.

適量TP 分散于水中，制得4 mg／mL TP NPs 溶液，取4 mL TP NPs溶液至透析袋（MWCO 3 500u），以100mL 含0.1%（質(zhì)量濃度）Tween 80的pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）為釋放介質(zhì)，37℃、100r／min振蕩溫育；分別于設(shè)定時(shí)間取樣0.5 mL，補(bǔ)加0.5 mL 釋放介質(zhì)；樣品12 000r／min 離心10min，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定PTX 濃度，計(jì)算累計(jì)釋放量.色譜條件：色譜柱Hypersil ODS2柱（中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，200×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為52∶48（體積比）的乙腈∶水；流速為1mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為227nm；進(jìn)樣量為20μL.

1.6 在體小腸黏附

稱取3mg RhB，加1mL pH 4.5HCl溶液溶解，加1.5mg NHS和3mg EDC·HCl，避光攪拌1h；稱取0.3g TMC，加9 mL 水溶解，加至RhB 體系中，避光攪拌24h；反應(yīng)液以水透析3d（MWCO 3 500u），冷凍干燥，得RhB標(biāo)記的TMC.以RhB標(biāo)記的TMC替代TMC，按1.2項(xiàng)下方法制備RhB標(biāo)記的TP NPs.

SD 大鼠，禁食12h，可自由飲水，麻醉后沿腹中線打開(kāi)腹腔，取約10cm 回腸腸段，生理鹽水沖洗至凈，兩端用手術(shù)線結(jié)扎成封閉腸環(huán)，腸環(huán)中注入1mL RhB標(biāo)記的TMC或TP NPs（1mg／mL）溶液；將腸段放回腹腔，2h后處死大鼠，剪開(kāi)腸環(huán)收集腸液，加生理鹽水沖洗腸段，合并腸液和沖洗液，酶標(biāo)儀測(cè)定RhB標(biāo)記的TMC或TP NPs含量（λex＝560nm，λem＝590nm）.

1.7 小腸離體轉(zhuǎn)運(yùn)

PTX 溶液配制：以聚氧乙烯蓖麻油／無(wú)水乙醇（1∶1，體積比）配制1mg／mL PTX 貯備液，使用時(shí)以Kreb's－Ringer緩沖液稀釋至100μg／mL；PTX／TMC混合液配制：配制10mg／mL TMC溶液，使用時(shí)將PTX 貯備液、TMC溶液和Kreb's－Ringer緩沖液按1∶1∶8（體積比）混合.

SD 大鼠，禁食12h，可自由飲水.頸椎脫臼處死，沿腹中線打開(kāi)腹腔取出回腸，以Kreb's－Ringer緩沖液清洗干凈，剪成約7cm 長(zhǎng)，兩端約1cm 處用手術(shù)線結(jié)扎形成封閉腸環(huán)，腸環(huán)內(nèi)分別注入0.5mL PTX溶液、PTX／TMC混合液、TP NPs溶液（濃度按PTX 計(jì)均為100μg／mL）.腸環(huán)置高型稱量瓶中，加入5mL 37℃氧氣飽和的Kreb's－Ringer緩沖液，使腸環(huán)保持拉伸狀態(tài)，37℃、100r／min振蕩溫育.分別于30，60，90，120，180min取樣200μL，補(bǔ)加37℃Kreb's－Ringer緩沖液200μL.樣品12 000r／min離心15min，按1.5項(xiàng)下HPLC法測(cè)定樣品中PTX 含量，計(jì)算PTX 的表觀滲透系數(shù)（Papp）.

2 結(jié)果與討論

2.1 TP的制備與表征

圖1為TP和TP NPs的合成路線.以二氯甲烷為溶劑，琥珀酸酐以吡啶催化開(kāi)環(huán)，與PTX 的2'位羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，真空干燥得PTX－suc.采用分子質(zhì)量分別為30ku和200ku的殼聚糖與碘甲烷反應(yīng)合成了TMC.TMC與PTX－suc在DMSO／水混合溶劑中經(jīng)EDC／NHS催化縮合制得TP.TP含有親水性聚合物和疏水性藥物，水中可自組裝形成納米粒.圖2為TMC 和TP的1H NMR 圖譜.經(jīng)1H NMR 圖譜計(jì)算TMC的季銨化度約為30%［9］，TP的1H NMR 圖譜中7.3×10－6～8.0×10－6和3.1×10－6～4.0×10－6的信號(hào)峰分別為PTX 苯環(huán)和殼聚糖糖環(huán)上的質(zhì)子峰，表明PTX 已連接至TMC上，制得聚合物－藥物連接物TP.

圖1 TP和TP NPs的合成路線Fig.1 Synthetic route of TP and TP NPs

2.2 粒徑、Zeta電勢(shì)及形貌

TP（30）NPs和TP（200）NPs水中平均粒徑分別為（166.2±10.8）nm 和（193.7±15.1）nm，Zeta電勢(shì)分別為（31.6±1.9）mV和（32.1±2.0）mV.圖3（a）和（b）分別為TP（30）NPs和TP（200）NPs的SEM 圖，可見(jiàn)納米粒近似球形，表面光滑，粒徑為100～200nm，粒徑分布均勻且分散性較好.如圖3（c）和（d）所示，模擬胃腸道環(huán)境的不同pH 條件下，TP NPs粒徑無(wú)顯著變化，表明TP NPs可在胃腸道環(huán)境中保持納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.采用熒光探針芘，測(cè)定兩親性聚合物的CMC.圖3（e）和（f）為I335／I333對(duì)lg C 線性回歸，I335／I333變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的濃度即為CMC［10］.TP（30）NPs和TP（200）NPs的CMC較小，分別為0.065和0.039mg／mL，表明TP NPs在生理環(huán)境中經(jīng)稀釋后也可較好的保持粒子狀態(tài).

圖2 TMC和TP的1 H NMR 圖譜Fig.2 1 H NMR spectra of TMC and TP

圖3 TP（30）NPs（a）和TP（200）NPs（b）的SEM 圖；pH 1.2，5.0，6.8和7.4下TP（30）NPs（c）和TP（200）NPs（d）的粒徑（n＝3）；TP（30）NPs（e）和TP（200）NPs（f）的I335／I333對(duì)lg［C／（mg·mL－1）］線性回歸Fig.3 SEM images of TP（30）NPs（a）and TP（200）NPs（b）；Particle sizes of TP（30）NPs（c）and TP（200）NPs（d）at pH 1.2，5.0，6.8，and 7.4.Indicated values were mean±SD（n＝3）；Variation of intensity ratio（I335／I333）versus logarithmic concentrations of TP（30）NPs（e）and TP（200）NPs（f）

2.3 載藥量與體外釋放

TP（30）NPs和TP（200）NPs的載藥量分別為11.0%和11.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）.圖4為TP NPs在0.2mol／L pH 7.4PBS中的PTX 釋放曲線.藥物物理包埋于納米粒后的釋藥行為一般包括初期突釋和后期緩釋，而自組裝的聚合物－藥物連接物TP NPs需將藥物化學(xué)連接鍵水解后方可釋放PTX 至介質(zhì)中，故無(wú)明顯突釋，可持續(xù)緩慢釋放藥物達(dá)10d.PTX 釋放速率隨聚合物分子質(zhì)量的增大而減小，這是由于分子鏈較長(zhǎng)的TP 可使釋放介質(zhì)黏度增加，且形成的納米粒纏繞較緊密［6，11］.

圖4 TP NPs在pH 7.4PBS中的PTX 釋放曲線Fig.4 In vitro PTX release profiles from TP NPs in pH 7.4PBS

2.4 在體小腸黏附與小腸離體轉(zhuǎn)運(yùn)

圖5（a）為TP NPs的在體小腸黏附率，可見(jiàn)TP（30）NPs和TP（200）NPs的小腸黏附率分別為相應(yīng)TMC的1.9和2.0倍.TMC 荷正電，可與小腸黏膜表面荷負(fù)電的黏蛋白靜電吸附富集于黏液層；TMC與PTX 連接后，疏水性增強(qiáng)，可與黏膜黏蛋白和小腸上皮細(xì)胞經(jīng)疏水作用結(jié)合，故小腸黏附力提高［2］.圖5（b）為PTX、PTX／TMC和TP NPs在離體小腸中的Papp，可見(jiàn)，TP（30）NPs和TP（200）NPs均可顯著促進(jìn)PTX 的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)，Papp分別為游離PTX 的13.1 和6.1 倍.TP NPs的促滲透作用可能歸因于：（1）TP NPs荷正電，可與小腸上皮細(xì)胞緊密連接處的荷負(fù)電類脂質(zhì)作用，打開(kāi)緊密連接，從而促進(jìn)PTX經(jīng)胞間途徑轉(zhuǎn)運(yùn)［12］；（2）TP NPs可同時(shí)經(jīng)靜電作用和疏水作用黏附至細(xì)胞膜，被小腸上皮細(xì)胞攝取后經(jīng)胞內(nèi)途徑轉(zhuǎn)運(yùn)［13］；（3）PTX 是P－gp的底物，PTX 連接至TMC并形成納米粒，可避免被小腸上皮細(xì)胞Pgp藥物流出泵排出，提高PTX 的轉(zhuǎn)運(yùn)效率［3］.TP（200）NPs的促滲透作用弱于TP（30）NPs，這可能是由于TP（200）NPs分子鏈過(guò)長(zhǎng)，穿透上皮細(xì)胞層的能力減弱，故小腸轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低［6］.分子質(zhì)量為30ku和200ku的TMC溶液分別與PTX 物理混合，PTX／TMC組的Papp分別為游離PTX 的1.8和3.6倍，這是由于物理混合液中TMC可打開(kāi)小腸緊密連接促進(jìn)游離PTX 的小腸轉(zhuǎn)運(yùn).

圖5 （a）TMC和TP NPs的在體小腸黏附率；（b）PTX、PTX／TMC和TP NPs在離體小腸中的PappFig.5 （a）Mucoadhesion of TMC and TP NPs；（b）Pappof PTX in excised rat ileum

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)并合成用于口服遞送PTX 的聚合物－藥物連接物TP，TP 在水中可自組裝形成平均粒徑小于200nm 且粒徑均一的TP NPs，模擬胃腸道環(huán)境的不同pH 條件下粒徑穩(wěn)定；TP NPs在pH 7.4PBS中可持續(xù)緩慢釋放藥物達(dá)10d；TP NPs小腸黏膜黏附力強(qiáng)，可通過(guò)打開(kāi)小腸上皮細(xì)胞緊密連接、促進(jìn)上皮細(xì)胞攝取等發(fā)揮促滲透作用.因此，可自組裝的TP NPs有望在腫瘤治療中用于口服遞送化療藥物.

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