姜新舒，姚 ?。ū本┛萍即髮W環(huán)境與工程系，北京 100083）

草甘膦對同源假單胞基因工程菌代謝活性的影響

姜新舒，姚 俊*（北京科技大學環(huán)境與工程系，北京 100083）

基于微量熱法，研究兩株基因缺失型斯氏假單胞桿菌對草甘膦的耐受毒性和降解作用，結果表明：草甘膦可以作為菌株的能量來源；草甘膦對P.stutzeri WM 581和P.stutzeri WM 567的半抑制濃度分別為47.47，43.26mg/L.兩菌株對草甘膦均有較快的降解速率，其降解的半衰期約為9～17h，而草甘膦作為2類菌株生長過程中可以代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，其作為唯一碳源時的降解率（64%）要高于作為磷源時的降解率（43%）.pH值與鹽度對兩菌株的生長有較大影響，草甘膦降解的較佳條件為：pH值為6，鹽度低于0.5g/L.

微量熱法；草甘膦；斯氏假單胞桿菌

目前，有機磷農(nóng)藥為應用最廣、品種最多的農(nóng)藥品種［1］.其中草甘膦作為廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導型有機磷除草劑［2］，在世界上應用最廣、產(chǎn)量最大，其在土壤中的殘留積累給環(huán)境（包括土壤、水體、大氣）安全帶來了一定風險［3-4］.

自然界中草甘膦等有機磷農(nóng)藥的降解主要包括光解、化學降解和微生物降解［5］.其中，微生物降解因為其能耗低，不易造成二次污染而成為研究熱點.目前，國內(nèi)外報道的可降解草甘膦的細菌有節(jié)桿菌［6］、假單胞菌［7］、產(chǎn)堿桿菌、無色桿菌［8］、產(chǎn)黃菌［9］、節(jié)細菌［10］等，真菌有膠紅酵母菌［11］、米曲霉菌［12］、假絲酵母菌和解脂亞羅酵母菌等［13］.目前，國內(nèi)對微生物降解草甘膦的研究主要集中在降解菌的篩選鑒定、微生物降解草甘膦的動力學研究和最優(yōu)降解條件的探索，而農(nóng)藥與微生物作用過程中的微生物新陳代謝活動的影響研究較少，缺乏從代謝熱力學角度研究微生物和草甘膦的相互影響.

微量熱儀能夠靈敏地監(jiān)測微生物生長代謝過程中伴隨的產(chǎn)熱量，作為細胞代謝的重要生理參數(shù)，可以通過產(chǎn)熱量的差異探究活細胞代謝強度及與環(huán)境要素的相關性.剖析細菌實時生長熱譜圖，可以獲得細菌生長的熱力學參數(shù)，如生長速率常數(shù)、總代謝熱.對這些熱力學參數(shù)進行分析，可從代謝熱角度揭示外源物質(zhì)對細菌的影響程度，并且是實時在線原位的監(jiān)測細菌的產(chǎn)熱量變化.而常規(guī)生物學方法是特異性的、間斷、非原位的測定細菌的生化指標，這可能導致部分關鍵作用過程的缺失.基于微量熱測定的非特異性的優(yōu)點，近年來，微量熱儀已經(jīng)廣泛地應用于各種污染物對細菌生長、代謝的影響以及大分子功能或細胞之間的相互作用等研究［14-17］.

本研究從細菌代謝熱角度研究2株斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri WM 567和Pseudomonas stutzeri WM 581）在草甘膦作用下代謝活性差異，明確由基因差異而引起的活性的變化；另外，通過降解實驗，證明2株斯氏假單胞菌對草甘膦也具有一定的降解能力，以證明環(huán)境中具有有機污染物降解功能的微生物也受到所降解物質(zhì)的抑制，為進一步了解降解微生物的生理代謝提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1．1 農(nóng)藥 草甘膦（北京鹽化永樂農(nóng)藥有限公司，商品名美安達，草甘膦異丙胺鹽含量41%，草甘膦含量30%）

1.1．2 菌株 P.stutzeri WM 567，P.stutzeri WM 581（由美國耶魯大學地學系環(huán)境地球化學課題組提供）.所用到的斯氏假單胞菌是Pseudomonas stutzeri WM 567和Pseudomonas stutzeri WM 581，它們是通過改造能夠利用有機磷化合物為磷源的野生菌株Pseudomonas stutzeri WM 88基因而得到的.Pseudomonas stutzeri WM 567是通過基因工程技術將2種不同質(zhì)粒pWM238、pWM 239克隆到野生菌株Pseudomonas stutzeri WM 88的質(zhì)粒pWM 95中構建的突變菌株，此菌株對鏈霉素具有抗性，對次磷酸和亞磷酸呈陽性反應（能夠?qū)⑵溲趸癁殪⑺幔?Pseudomonas stutzeri WM 581是通過改造Pseudomonas stutzeri WM 567而得到的突變菌株，該菌株對次膦酸和亞膦酸呈陰性反應（不能夠?qū)⑵溲趸癁殪ⅲ?8-19］.

1.1．3 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10， 酵母提取物5， NaCl 10， 瓊脂粉15.牛肉湯營養(yǎng)培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5.無機鹽葡萄糖培養(yǎng)基：（NH4）2SO4375mg/L，MgSO475mg/L，CaCO330mg/L， FeSO4.7H2O 1mg/L，H3BO31×10-3mg/L， MnSO41×10-3mg/L， KH2PO42g/L， Na2HPO46g/L，葡萄糖1g/L.

1.1．4 實驗儀器 紫外可見光分光光度計（島津UV-1800，日本），十二通道微量熱儀（TAMIII Multi-channel Thermal Activity Monitor，美國TA儀器）.

1.2 方法

1.2．1 菌種的接種活化 將低溫保存的菌種轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d.將LB固體培養(yǎng)基上的菌株轉(zhuǎn)接到150mL牛肉湯營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行一次活化，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)3d.按2%接種量轉(zhuǎn)接到150mL無機鹽葡萄糖培養(yǎng)基中進行2次活化，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)3d.

1.2．2 草甘膦對菌株生長的影響 按2%的接種量在150mL無機鹽葡萄糖培養(yǎng)基中接種菌株，P.stutzeri WM 567中草甘膦濃度依次為0，50，200，600，1000，2500mg/L，P.stutzeri WM 581中草甘膦濃度依次為0，26，50，100，200，400，600mg/L，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，每隔2h用紫外分光光度計測量其在600nm波長下的吸光度值（OD），繪制OD600—時間曲線.草甘膦對菌株生長影響實驗設置3個重復，取其平均值.

1.2．3 微量熱測量草甘膦對菌株代謝活性的影響 不銹鋼安瓿瓶先后用自來水、超純水沖洗，放入35℃超聲波清洗機清洗30min，重復3次，再次用超純水沖洗并烘干、滅菌.向不銹鋼安瓿瓶中加入2mL無機鹽葡萄糖液體培養(yǎng)基（根據(jù)草甘膦對菌株生長影響實驗，選取草甘膦濃度梯度值為0，50，100，200，400mg/L），再用移液槍向安瓿瓶中接種菌液，設置無菌空白對照.將安瓿瓶置于微量熱儀中，并記錄28℃條件下的熱功率-時間曲線.

1.2．4 草甘膦標準曲線的繪制 草甘膦標準液的配制：稱取0.30g草甘膦（30%水劑）置于200mL燒杯中，加入60mL水溶解.轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中定容并搖勻（使用時間不得超過20d），得到360mg/L的草甘膦標準液.精確吸取0.00，0.05，0.125，0.25，0.5，0.75mg草甘膦標液于5個10mL容量瓶中定容，將樣品進行亞硝基化反應［20］.使用紫外可見光分光光度計測量上述溶液在243nm［20］處的吸光度，設置空白對照，繪制標準曲線.

1.2．5 菌株對草甘膦降解作用的測定 分別以草甘膦為唯一磷源、唯一碳源及碳源和磷源，配制無機鹽培養(yǎng)基（以草甘膦替代無機鹽葡萄糖培養(yǎng)基中的相應營養(yǎng)物質(zhì)，草甘膦濃度為80mg/L）.按2%的接種量接種P.stutzeri WM 567、P.stutzeri WM 581，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，分別在6，9，12，17h取2mL草甘膦降解菌液，13000r/min離心取上層清液，亞硝基化紫外分光光度法［20］測量草甘膦含量.定時取樣測定菌液OD600值.每個降解實驗設置3個重復.

1.2．6 環(huán)境因素對2株菌降解草甘膦的影響用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)無機鹽葡萄糖培養(yǎng)基pH值分別為4、6、8、10、12.鹽度分別為0，533，1000，3000，5000mg/L.17h后取樣，測定不同pH值和鹽度下草甘膦的最終含量.每個環(huán)境因素對2株菌降解草甘膦的影響實驗設置3個重復.

2 結果與討論

2.1 草甘膦對菌株生長的影響

圖1 草甘膦對菌株生長的影響Fig.1 The effects of glyphosate on the growth of strain

如圖1所示，隨著草甘膦濃度的增加，P.stutzeri WM 581、P.stutzeri WM 567 2株菌生長的適應期延長，對數(shù)期縮短，穩(wěn)定期的峰值降低.當草甘膦濃度達400mg/L以上，2株菌的生長完全被抑制，為微量熱實驗的草甘膦濃度選取提供依據(jù).

2.2 草甘膦對2株菌代謝活性的影響

通過熱力學動力方程：

計算獲得微生物生長速率常數(shù)k.式中：Pt為時間t時所測得的細菌總熱功率，P0為時間t0時的細菌總熱功率，微生物活性越高、生長越快，則k值越大.

草甘膦對細菌生長代謝過程的抑制率I為：

式中：k0為微生物未受到抑制時生長代謝的速率常數(shù)，kc為微生物受到濃度為c的草甘膦抑制作用時的速率常數(shù).當抑制率I為50%時所對應的草甘膦濃度為半抑制濃度.

微量熱譜圖顯示，草甘膦對P.stutzeri WM 581、P.stutzeri WM 567兩株菌的毒性影響基本一致，說明，所改造的基因del3（Bsi WI）∷aph［18，19］并未改變菌株對草甘膦的耐受性.在較低濃度（50mg/L）時草甘膦對菌株生長起到了促進作用，隨著濃度的增高，其對菌株的抑制作用才逐漸顯現(xiàn)出來.從功率-時間曲線參數(shù)中可以看到（圖2）：草甘膦使功率曲線出峰時間后移，當其濃度為50mg/L時，k值降低，而最大熱功率和總放熱量增加，說明雖然較低濃度的草甘膦使微生物的生長速率降低，但菌株的活性增大；隨著濃度繼續(xù)增加，最大熱功率和總放熱量降低，說明草甘膦對微生物的毒性增大，菌株活性被抑制.陶波等［21］報道低濃度草甘膦對鐮刀菌產(chǎn)生激活作用，高濃度草甘膦對鐮刀菌具有抑制作用.當草甘膦濃度達到400mg/L時，最大熱功率值和總放熱量均有小幅回升，這說明此時微生物產(chǎn)生了應急反應，這與在400mg/L時檢測到微生物基本不生長的實驗現(xiàn)象相符.

P.stutzeri WM 581和P.stutzeri WM 567均為P.stutzeri WM88的突變衍菌株.William等［18］已經(jīng)證明P.stutzeri WM88的染色體上存在編碼C-P裂解酶的基因，并且這種C-P裂解酶可以在還原態(tài)含P化合物中起到一定作用.該報道推測P.stutzeri WM88的染色體上還存在另外一種未知的編碼C-P裂解酶的基因.本研究所用的P.stutzeri WM 567是自發(fā)對鏈霉素產(chǎn)生抗性的平滑型P.stutzeri WM88衍生菌株，它能夠氧化低價態(tài)的P化合物.P.stutzeri WM 581相對于P.stutzeri WM 567缺失基因片段del3（Bsi WI）∷aph，致使其不能夠氧化低價態(tài)的P化合物.對比這兩株同源假單胞基因工程菌，草甘膦對其代謝活性的影響基本一致.因此，從菌株代謝角度提出兩種猜測：（1）對于已知的編碼C-P裂解酶的基因，P.stutzeri WM 581缺失的基因片段并不影響其合成C-P裂解酶；（2）P.stutzeri WM 581缺失的基因片段致使其不能正常合成C-P裂解酶，但是其染色體上另外一種未知的編碼C-P裂解酶的基因在代謝中起到了作用，從而使草甘膦對其代謝活性的影響與P.stutzeri WM 567基本一致，而這種未知的編碼C-P裂解酶的基因需要進一步通過分子生物學方法去研究、證實.

圖2 P.stutzeri WM 567與P.stutzeri WM 581在不同草甘膦濃度下的功率-時間曲線Fig.2 Power-time curves of P.stutzeri WM 567 and P.stutzeri WM 581 at a series of concentrations of glyphosate

圖3 草甘膦對菌株的半抑制濃度Fig.3 The half inhibitory concentration of glyphosate on strains

如圖3所示，隨草甘膦濃度增加，對P.stutzeri WM 567和P.stutzeri WM 581抑制率增大.草甘膦對兩株基因工程菌的抑制程度基本保持一致，具有相同的上升趨勢，草甘膦對P.stutzeri WM 581的半抑制濃度為47.47mg/L，對P.stutzeri WM 567的半抑制濃度為43.26mg/L.說明P.stutzeri WM 581菌株對草甘膦的抗性比P.stutzeri WM 567稍強，進一步說明P.stutzeri WM 567能夠氧化草甘膦為磷酸，降低草甘膦的脅迫，尤其表現(xiàn)在低濃度下（100mg/L），而去除基因片段del3（Bsi WI）∷aph的P.stutzeri WM 581由于沒有顯著的氧化作用，表現(xiàn)出完全的脅迫，導致其細胞釋放更多的熱量來維持其自身的新陳代謝，釋放更多的熱量.如表1所示，在50，100mg/L草甘膦作用下，P.stutzeri WM 581分別釋放12.13，10.2J的熱量，高于P.stutzeri WM 567釋放的熱量（分別為10.8，5.86J）.但在高濃度作用下（＞100mg/L），草甘膦的脅迫作用加強，導致毒性加大，細胞的新陳代謝受到強烈的抑制或者停滯，導致釋放的熱量進一步減少.在高濃度下，具有氧化功能的P.stutzeri WM 567由于正常的新陳代謝活動的抑制，其潛在的氧化能力也相應減弱，釋放熱量也進而降低.上述結果證明了在低污染物濃度下，具有降解功能的微生物在降解污染物的過程中釋放較低的熱量，而不具備降解功能或弱降解功能的微生物在脅迫作用下釋放更多的熱量，這為了解污染物與降解菌的作用機制提供了良好的基礎.

表1 微量熱監(jiān)測草甘膦對菌株的毒性參數(shù)Table 1 Calorimetric parameters of glyphosate toxicity for strains

2.3 兩株菌對草甘膦的降解作用

如圖4、圖5所示，以草甘膦為唯一磷源的培養(yǎng)液中，細菌明顯比以草甘膦為唯一碳源、以草甘膦為磷源和碳源時生長的更為迅速，但是草甘膦的降解率并沒有其他2種情況高.與草甘膦作為碳源的培養(yǎng)基相比，草甘膦為磷源的培養(yǎng)基中有葡萄糖作為碳源和能源物質(zhì)，為細菌生長提供了營養(yǎng)，使細菌生長更為迅速.說明微生物生長優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源和能源物質(zhì)，而草甘膦是細菌在污染脅迫情況下可以利用的營養(yǎng)物質(zhì).這與石成春等［22］報道的在草甘膦和葡萄糖組成的共基質(zhì)底物系統(tǒng)中，微生物優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源和能源物質(zhì)相符.此外，以草甘膦為磷源的培養(yǎng)基中，葡萄糖的初始濃度（1g/L）相對于草甘膦的初始濃度（80mg/L）較高，由于共基質(zhì)代謝過程中不同底物之間存在競爭抑制作用，高濃度的葡萄糖反而會抑制草甘膦的共代謝降解速率［23］.

本部分實驗表明P.stutzeri WM 581和P.stutzeri WM 567對草甘膦具有一定的降解作用，微量熱實驗表明菌株生長被高濃度草甘膦抑制，證明環(huán)境中具有有機污染物降解功能的微生物也受到所降解物質(zhì)的抑制.產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因為草甘膦濃度較低時，可以激發(fā)降解酶催化活性，草甘膦作為營養(yǎng)物質(zhì)被利用，從而增大了菌株的活性；當?shù)孜餄舛瘸^臨界值后，草甘膦與降解酶形成多元絡合物，從而抑制了酶的降解活性［24］，草甘膦難以被微生物利用，因此菌株的活性降低.

圖4 草甘膦作為不同營養(yǎng)物質(zhì)時對菌株生長的影響Fig.4 The effects of glyphosate serving as different nutrients on the growth of strains

圖5 P.stutzeri WM 581和P.stutzeri WM 567對草甘膦的降解效率Fig.5 The degradation rate of glyphosate by P.stutzeri WM 581和P.stutzeri WM 567

2.4 環(huán)境因素對兩株菌降解草甘膦的影響

如圖6所示，當pH值增大接近6時，對草甘膦的降解率達到最大值44% （P.stutzeri WM 567）和48%（P.stutzeri WM 581）.pH值繼續(xù)增大，草甘膦的降解率隨之降低，菌株降解草甘膦的pH最適值均為6.不同微生物降解草甘膦的最優(yōu)pH值均6.5～7.5［6，12，25］.隨著NaCl濃度的升高，草甘膦的降解率增加，當NaCl濃度達到0.5g/L時，草甘膦的降解率最高達到51%（P.stutzeri WM 567）、53%（P.stutzeri WM 581）.但當NaCl濃度繼續(xù)升高，草甘膦的降解率降低.菌株降解草甘膦的NaCl最適濃度為0.5g/L，與葉明等［25］的研究一致.

圖6 pH值與NaCl濃度對草甘膦降解率的影響Fig.6 The effects of pH and NaCl concentration on degradation rate of glyphosate

3 結論

3.1 草甘膦對2株同源假單胞基因工程菌P.stutzeri WM 581、P.stutzeri WM 567的毒性影響基本一致：低濃度促進生長、高濃度抑制生長.所改造的基因del3（Bsi WI）∷aph并未改變菌株對草甘膦的耐受性.為P.stutzeri染色體上存在另外一種未知的編碼C-P裂解酶基因提供證據(jù).

3.2 草甘膦對P.stutzeri WM 581、P.stutzeri WM 567的半抑制濃度分別為47.47，43.26mg/L.說明P.stutzeri WM 581對草甘膦的抗性比P.stutzeri WM 567稍強.微量熱實驗表明，低污染物濃度下，具備降解功能的微生物在降解污染物的過程中釋放較低的熱量，而不具備降解功能或弱降解功能的微生物在脅迫作用下釋放更多的熱量.

3.3 菌株生長被高濃度草甘膦抑制，證明環(huán)境中具有有機污染物降解功能的微生物也受到所降解物質(zhì)的抑制.兩菌株對草甘膦均有較快的降解速率，其降解半衰期約為9～17h，而草甘膦作為菌株生長過程中可以代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，其作為唯一碳源時的降解率（64%）要高于作為磷源時的降解率（43%）.pH值與鹽度對菌株的生長有較大影響，草甘膦降解的較佳條件為：pH6，鹽度低于0.5g/L.

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Metabolic activity effects of glyphosate on homologous gene engineering bacteria of Pseudomonas.

JIANG Xin-shu，YAO Jun*（Department of Environmental Science and Engineering， University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083， China）. China Environmental Science， 2015，35（10）：3078～3084

On the basis of microcalorimetric technology， we investigated the effect of glyphosate on metabolic activity of two homologous gene engineering bacteria of Pseudomonas. Glyphosate can serve as nutrients of these two strains.The half inhibitory concentration of glyphosate for P.stutzeri WM 581 and P.stutzeri WM 567 were 47.47mg/L and 43.26mg/L respectively. Both of strains can degrade glyphosate rapidly， and the half-life was approximate 9～17 hours. And as metabolism nutrients of these two strains， the degradation rate of glyphosate as carbon source （64%） is higher than as phosphorus source （43%）. Salinity and pH impacted the growth of these two strains remarkably， the relatively optimal condition to degrade glyphosate is： pH = 6， NaCl ＜ 0.5g/L.

microcalorimetry；glyphosate；Pseudomonas strains

X172

A

1000-6923（2015）10-3078-07

姜新舒（1991-），女，遼寧本溪人，北京科技大學碩士研究生，主要從事微生物修復有機磷農(nóng)藥污染的研究工作.

2015-03-19

國家杰出青年科學基金資助項目（40925010）

* 責任作者， 教授， yaojun@ustb.edu.cn