陳曉鵬，胡永成，方成，張麗娟，張榮信，黃文敬

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市天津醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，天津 300211）

血紅素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用

陳曉鵬1，胡永成2，方成1，張麗娟1，張榮信1，黃文敬1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市天津醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，天津 300211）

目的：探討應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)血紅素氧化酶1（HO-1）基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)脂肪來源基質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和成骨分化的影響。方法：取健康10周齡SD大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪，分離、培養(yǎng)ADSCs，觀察第3代細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行成骨和成脂分化研究，流式分析細(xì)胞表面標(biāo)記物，確立分離細(xì)胞為ADSCs。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建HO-1基因重組慢病毒載體，并以Polybrene（8 μg/mL）介導(dǎo)慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs，倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)優(yōu)化轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)，Western blot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)。設(shè)HO-1轉(zhuǎn)染組（A組）、空載體轉(zhuǎn)染組（B組）和未轉(zhuǎn)染組（C組）；MTT，流式分析和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色分別檢測(cè)各組增殖、凋亡和成骨分化情況。結(jié)果：分離獲得的ADSCs具有多向分化潛能：CD29（+）、CD44（+）、CD90（+）、CD31（-）、CD45（-）；經(jīng)菌液PCR和Western blot鑒定HO-1基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功，與B、C組相比，A組具有較高的細(xì)胞活性（P＜0.05），無血清培養(yǎng)基中較低的凋亡率（P＜0.05），并增加細(xì)胞鈣化基質(zhì)形成的量（P＜0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建HO-1基因重組慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs，HO-1基因轉(zhuǎn)染入ADSCs后表達(dá)HO-1蛋白成功，HO-1轉(zhuǎn)染后可以發(fā)揮對(duì)ADSCs促增殖、抗凋亡和促成骨分化的作用。

脂肪基質(zhì)干細(xì)胞；血紅素氧化酶1；慢病毒載體；成骨分化

骨組織工程為骨缺損修復(fù)提供了一種有效的方法，其中脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）因取材方便、易獲得，具有多種定向分化潛能的特點(diǎn)成為骨組織工程良好的種子細(xì)胞［1］。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ADSCs成骨分化及其促進(jìn)骨缺損修復(fù)等功能進(jìn)行了大量研究。但單純的ADSCs植入體內(nèi)后細(xì)胞大量凋亡，且ADSCs較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）有脂肪分化的潛能［2］。血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是血紅素代謝的限速酶，因其可以通過一種或幾種代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗凋亡、抗炎等作用而受到重視［3］。將HO-1基因修飾ADSCs有望克服以上不足，更好地發(fā)揮血管新生和成骨分化的促進(jìn)作用。因此，我們構(gòu)建了攜帶HO-1基因的慢病毒，將其感染ADSCs，長(zhǎng)期傳代，獲得持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器10周齡清潔雄性SD大鼠8只，體質(zhì)量200～300 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)研究院。

FBS（HyClone公司，美國(guó)）；L-DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國(guó)）；雙抗（青霉素-鏈霉素，GIBCO公司，美國(guó)）；聚凝胺（polybrene），I型膠原酶，抗壞血酸，地塞米松，β-甘油磷酸鈉，甲基黃嘌呤（IBMX），吲哚美辛（Sigma公司，美國(guó)）；磷酸鹽緩沖液（PBS），茜素紅（生工，中國(guó)）。慢病毒載體pZsGGFP、包裝質(zhì)粒packA、packB、packC，293T細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室張榮信教授惠贈(zèng)；質(zhì)粒pUC57-HO-1由金唯智（蘇州，中國(guó)）合成，Plasmid抽提試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)），大鼠HO-1抗體（Santa Cruz生物公司，美國(guó)），CD29-PE，CD31-APC，CD44-PE，CD45-FITC，CD90-FITC（BD eBioscience，美國(guó)）。Plus-20離心超濾裝置（Millipore公司，美國(guó)）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Accuri C6流式細(xì)胞儀（BD，加拿大）。

1.2 大鼠ADSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1 大鼠ADSCs分離、培養(yǎng)無菌條件下取脂肪組織置入無菌離心管中，PBS沖洗3遍，剔除血管、筋膜組織后剪碎，0.1％Ⅰ型膠原酶37℃震蕩消化1 h，等體積DMEM/體積分?jǐn)?shù)10％的FBS中和，采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠ADSCs，1 000 r/min，離心5 min，0.22 μm篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用DMEM培養(yǎng)基含10％的FBS和1％雙抗培養(yǎng)。48 h后換液，除去未貼壁的細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至80％～90％融合狀態(tài)時(shí)，0.05％胰蛋白酶-0.02％ EDTA消化傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 大鼠ADSCs鑒定倒置顯微鏡下觀察ADSCs形態(tài)及其生長(zhǎng)變化；在成骨（DMEM，5％FBS，1％雙抗，0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）和成脂（DMEM，5％ FBS，1％雙抗，10 mg/L胰島素+1 μmol/L地塞米松、100 μmol/L吲哚美辛、500 μmol/L的甲基黃嘌呤）培養(yǎng)基上誘導(dǎo)21 d培養(yǎng)ADSCs，每3 d換液，觀察其多分化潛能；流式細(xì)胞儀分析ADSCs表面CD29、 CD44、CD90、CD31、CD45分子的表達(dá)。

1.3 HO-1慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及HO-1慢病毒獲取

1.3.1 PCR法獲得HO-1基因片段從Genebank中提取大鼠HO-1基因（NM_012580）編碼區(qū)序列，根據(jù)慢病毒表達(dá)載體pZsG酶切位點(diǎn)要求，由金維智公司將HO-1基因合成在質(zhì)粒pUC57-HO-1中。將pUC57-HO-1和pZsG分別進(jìn)行NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶以膠回收試劑盒回收。

1.3.2 HO-1基因片段與慢病毒載體pZsG重組

切膠回收產(chǎn)物定向連接經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化，對(duì)長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，共挑選5個(gè)克隆。引物序列：上游引物5′-ATGGAGCGCCCACAGCTCG-3′，下游引物5′-ACTGCCACGGTCGCCAACAG-3′，其中PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆，證明HO-1已經(jīng)定向連入pZsG，命名為pZsG-HO-1。

1.3.3 慢病毒載體大量抽提按照Plasmid抽提試劑盒操作手冊(cè)步驟分別抽提慢病毒載體質(zhì)粒：pZsG-GFP、pZsG-HO-1、packA、packB和packC。保證所提質(zhì)粒DNA的吸光度（A260/A200）值為1.8～2.0，-20℃保存。

1.3.4 慢病毒包裝取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，包裝前按細(xì)胞密度1×105/mL接種于含完全培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合率約70％時(shí)，開始包裝。包裝前1 h更換無血清培養(yǎng)基，將上述表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒按1∶3∶1∶1的質(zhì)量比混合，再添加3倍體積的PEI，混勻后37℃孵育20 min，分別加入滿足包裝要求的293T細(xì)胞中。48 h和72 h后收集病毒上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HO-1重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染ADSCs取第3代大鼠ADSCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70％～80％融合后棄上清，加入10 mL的慢病毒液和8 μg/mL的聚凝胺（polybrene），置于37℃、5％CO2及飽和濕度孵育箱中孵育，6 h后全量換液，更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后根據(jù)空載體表達(dá)綠色熒光的特點(diǎn)，采用倒置熒光顯微鏡觀察不同感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10、15、20、30、50、100下慢病毒的感染效率，選擇熒光表達(dá)效率最高、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳的MOI值作為最佳MOI值進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot驗(yàn)證HO-1重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染ADSCs后表達(dá)情況。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ADSCs生長(zhǎng)情況根據(jù)處理方法不同分為3組：A組（HO-1基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染ADSCs）、B組（pZsG-GFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染ADSCs）、C組（未轉(zhuǎn)染ADSCs），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好不同組的第3代ADSCs，經(jīng)消化離心重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，按細(xì)胞密度1×103個(gè)/孔接種于96孔板中，于37℃、5％CO2及飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、6、7 d進(jìn)行MTT檢測(cè)，在酶聯(lián)免疫儀上490 nm下測(cè)定吸光度值（OD）。

隨著我國(guó)生活水平和醫(yī)療水平的提高，老年人的平均壽命不斷延長(zhǎng)，相對(duì)的老年人的可勞動(dòng)年齡也不斷延長(zhǎng)。老年人豐富的勞動(dòng)經(jīng)驗(yàn)和較于年輕人更敬業(yè)的勞動(dòng)精神是其具有的最核心的競(jìng)爭(zhēng)力。創(chuàng)造有利于老年人力資源開發(fā)的政策環(huán)境，充分開發(fā)老年人力資源，大力開展老年教育，不斷更新老年人的知識(shí)，鼓勵(lì)活到老學(xué)到老，使老年人適應(yīng)新科技的不斷創(chuàng)新，從而為其創(chuàng)造參與社會(huì)勞動(dòng)的有利條件。并且在老齡人工作經(jīng)驗(yàn)和技能指導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的工作領(lǐng)域上，適當(dāng)延長(zhǎng)老齡人的退休年齡增加勞動(dòng)力的供給，充分發(fā)揮利用老年勞動(dòng)力資源，彌補(bǔ)我國(guó)勞動(dòng)力數(shù)量的減少所帶來的劣勢(shì)。

1.5.2 流式細(xì)胞儀分析HO-1高表達(dá)對(duì)ADSCs抗凋亡的影響實(shí)驗(yàn)分組同1.5.1。按細(xì)胞密度1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后收集各組細(xì)胞。根據(jù)凋亡試劑盒（三箭，天津）要求進(jìn)行染色，C6流式分析儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.5.3 轉(zhuǎn)染后ADSCs成骨分化觀察實(shí)驗(yàn)分組同1.5.1。茜素紅染色：將3組細(xì)胞按細(xì)胞密度5×104個(gè)/孔接種于6孔板中，成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，PBS沖洗3次，每次5 min，無水甲醇固定10 min后，雙蒸水沖洗3次，每次5 min，加入pH 7.4的1％茜素紅染液，于37℃恒溫箱中孵育40 min，雙蒸水沖洗3次，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定原代細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)；成骨誘導(dǎo)3周后茜素紅染色可見多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)中有紅色顆?；虼笃t色沉淀。成脂誘導(dǎo)3周后油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)有紅色脂滴。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29（＋）、CD44（＋）、CD90（＋）、CD31（－）、CD45（－）（圖1）。

2.2 含HO-1的慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建HO-1基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ酶切后可獲得長(zhǎng)度為869 bp的片段產(chǎn)物（圖2A）。隨機(jī)挑選5個(gè)單克隆菌落行PCR鑒定，其中2、3、4為陽(yáng)性，片段大小約為900 bp（圖2B）。與Genbank中的參考序列一致，提示成功構(gòu)建HO-1基因慢病毒載體。

圖1 ADSCs形態(tài)學(xué)、多向分化潛能及表面標(biāo)記物鑒定Fig 1 Identification of ADSCs from morphology，multi-differentiation and surface marker

圖2 慢病毒表達(dá)載體pZsG-HO-1的構(gòu)建Fig2 Construction of lentiviral pZsG-HO-1 plasmid

2.3 重組慢病毒的感染效率及目的基因的表達(dá)

慢病毒感染ADSCs 96 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，結(jié)果顯示：當(dāng)MOI值為10、15時(shí)可見不足50％熒光表達(dá)；當(dāng)MOI值為20時(shí)，可見大部分（90％）ADSCs表達(dá)綠色熒光。當(dāng)MOI值為30時(shí)并不能有效增加熒光表達(dá)，且隨著MOI值的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，出現(xiàn)漂浮細(xì)胞，提示對(duì)大鼠ADSCs而言，MOI為20時(shí)為慢病毒的最佳感染復(fù)數(shù)，慢病毒感染ADSCs細(xì)胞達(dá)到90％以上的感染效率，符合基因治療對(duì)載體的要求（圖3）。Western blot結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組HO-1蛋白水平顯著高于空載體組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖3 不同梯度慢病毒MOI轉(zhuǎn)染ADSCs后熒光表達(dá)Fig 3The fluorescence of ADSCs transfected with the gradient MOI of lentivirus

圖4 Western blot檢測(cè)慢病毒介導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)染ADSCsFig 4HO-1 expression in ADSCs mediated by lentivirus and evidenced by Western blot

2.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ADSCs活性MTT法顯示：轉(zhuǎn)染后2 d開始，A組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，OD值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯變化，OD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞生長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，其中A 組OD值顯著優(yōu)于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

2.5 流式細(xì)胞技術(shù)分析轉(zhuǎn)染后ADSCs凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果（表1）表明，A組細(xì)胞凋亡率較B組和C組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而B組與C組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HO-1重組基因高表達(dá)可以降低ADSCs在無血清條件下的凋亡率，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

圖5 MTT檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組ADSCs的細(xì)胞活性Fig 5ADSCs viability of ADSCs in different transfection groups measured by MTT

表1 不同轉(zhuǎn)染組在無血清培養(yǎng)基下的凋亡率（％）Tab 1 The apoptosis rate of ADSCs in different groups in the medium without serum（％）

2.6 茜素紅鈣基質(zhì)染色轉(zhuǎn)染后3周，A組可見較多細(xì)胞出現(xiàn)大量片狀融合褐色礦化結(jié)節(jié)（圖6）；Image J軟件分析顯示，A組礦化結(jié)節(jié)形成區(qū)域較B組和C組明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而B組及C組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 茜素紅染色分析不同轉(zhuǎn)染組鈣基質(zhì)形成情況Fig 6Calcium deposition of different groups stained by alizarin red

3 討論

ADSCs具有多向分化潛能，為組織工程骨構(gòu)建增加了細(xì)胞成分，是目前骨組織工程的研究熱點(diǎn)，本研究中成功分離提取了ADSCs［1］。骨缺損局部微環(huán)境常面臨低氧、氧化應(yīng)激的損傷，不利于細(xì)胞存活，使得植入體內(nèi)的細(xì)胞早期凋亡率增加，1～2周內(nèi)細(xì)胞在支架上逐漸消失，4周后全部消失［4］。ADSCs聯(lián)合支架植入體內(nèi)達(dá)不到骨修復(fù)的效果［5］。同時(shí)植入體內(nèi)的種子細(xì)胞缺乏有效的刺激使其達(dá)到骨修復(fù)的目的。近年來，在心血管領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的HO-1通過代謝血紅素產(chǎn)生CO、膽綠素、二價(jià)鐵離子，可以發(fā)揮抗炎、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用，將其引入骨組織工程可能利于骨修復(fù)［6］。

與蛋白為基礎(chǔ)的治療相比，攜帶基因成本低、效率高，1996年第一次嘗試基因治療應(yīng)用于骨組織工程以來，基因治療在骨組織工程中得到了廣泛地研究［7］。為了更好地將目的基因與靶細(xì)胞整合，達(dá)到基因治療的目的，基因載體的選擇尤為關(guān)鍵。慢病毒載體能夠攜帶目的基因與靶細(xì)胞基因組整合，使得目的基因能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，且具有不易誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)［8］。更重要的是，慢病毒載體可轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞，攜帶基因片段容量較大［9］。因此，我們研究中選擇慢病毒表達(dá)載體作為目的基因的攜帶工具。

本實(shí)驗(yàn)將通過NotⅠ和BamHⅠ酶切獲得的大鼠HO-1基因片段與經(jīng)相同酶切的慢病毒表達(dá)載體pZsG連接后轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并通過酶切電泳分析儀和設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行菌液PCR對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定，結(jié)果與GenBank中序列大體一致，初步驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒目的基因片段為大鼠HO-1基因。此外，Western blot證明HO-1基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染ADSCs并出現(xiàn)蛋白水平表達(dá)，表明慢病毒介導(dǎo)HO-1成功導(dǎo)入ADSCs中，建立HO-1/ADSCs模型。

骨生成過程涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化、基質(zhì)合成和成骨分化［10］。細(xì)胞活性是細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染HO-1基因后可維持較高的細(xì)胞活性，與HO-1在內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮的作用一致［3］，而血管平滑肌細(xì)胞中高水平的HO-1可以抑制細(xì)胞增殖［11］，HO-1這種細(xì)胞選擇性更有利于血管新生，但其作用機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。另外，HO-1在內(nèi)皮細(xì)胞中還具有抗凋亡的特性，將其作為生長(zhǎng)因子引入骨組織工程的種子細(xì)胞可能更有利。在四肢骨缺損常面臨缺血微環(huán)境，造成植入體內(nèi)的ADSCs處于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足、低氧等應(yīng)激狀態(tài)［12］，該實(shí)驗(yàn)通過體外采用無血清條件來模擬體內(nèi)環(huán)境，證實(shí)HO-1轉(zhuǎn)染組具有相對(duì)較低的細(xì)胞凋亡率，與之前很多關(guān)于保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷的研究一致［13］。良好的細(xì)胞活性和無血清狀態(tài)下的抗凋亡效應(yīng)，二者相輔相成共同保證參與骨生成的細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)，該研究中還證實(shí)轉(zhuǎn)染HO-1組可以促進(jìn)礦化基質(zhì)的合成，提示HO-1具有直接的促成骨效應(yīng)［3，14］。有趣的是，Zwerina等［15］研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和骨吸收，提示HO-1也可以參與骨重建過程，可能在骨修復(fù)的不同階段發(fā)揮不同的效應(yīng)。

綜上，HO-1在ADSCs可以發(fā)揮促增殖、抗凋亡的特性，同時(shí)，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)環(huán)境下可以促進(jìn)成骨分化，慢病毒介導(dǎo)HO-1轉(zhuǎn)染ADSCs有望作為種子細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程。

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（2015-03-03收稿）

Effect of proliferation，apoptosis and osteogenic differentiation of ADSCs transduced with heme oxygenase-1

CHEN Xiao-peng1，HU Yong-cheng2，F(xiàn)ANG Cheng1，ZHANG Li-juan1，ZHANG Rong-xin1，HUANG Wen-jing1
（1.Graduate School，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Department of Bone and Soft Tissue Tumors，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China）

Objective：To investigate the proliferation，apoptosis and osteogenic differentiation effect of heme oxygenase-1（HO-1）overexpression mediated by lentivirus on adipose-derived stromal cells（ADSCs）.Methods:Fat tissue was harvested from inguinal area of 10-week-old SD rats，after which ADSCs were isolated and cultured.The morphology of third passages were observed，the multidifferentiation effect and surface markers were investigated to identify ADSCs.The lentivirus vector containing HO-1 gene was constructed through genetic recombination.ADSCs were transfected by lenvirus with polybrene（8 μg/mL）.The multiplicity of infection was optimized and HO-1 expression in ADSCs was tested by Western blot.Cells were divided into three groups:ADSCs transfected with Lenti-HO-1 （group A），ADSCs transfected with empty vector（group B）and ADSCs（C group）.The proliferation，apoptosis and osteogenic differentiation effect were investigated by MTT assay，flow cytometry and alizarin red staining.Results：ADSCs had a multi-differentiation character，CD29（+），CD44（+），CD90（+），CD31（-），CD45（-）.The lentivirus containing HO-1 was constructed successfully evidenced by bacteria PCR and Western blot.Compared with group B and C，cells of group A had a better viability（P＜0.05），exhibited anti-apoptotic effect（P＜0.05）and more osteogenic differentiation（P＜0.05）.Conclusion:The lenvirus vector containing HO-1 gene is successfully constructed，and HO-1 could express in ADSCs transfected with Lenti-HO-1.HO-1 expression could enhance pro-viability and anti-apoptotic effect，and it could stimulate osteogenic differentiation of ADSCs.

adipose-derived stromal cells；heme oxygenase-1；lentivirus；osteogenic differentiation

Q81

A

1006-8147（2015）05-0379-06

天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（12JCYBJC16400），天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2011KY24）

陳曉鵬（1987-），男，碩士在讀，研究方向：骨損傷修復(fù)；通信作者：胡永成，E-mail:yongcheng.hu@yahoo.com。