張宇坤，王淑瑩，董怡君，顧升波，彭永臻

（北京工業(yè)大學北京市水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室，北京100124）

NaCl鹽度對氨氧化細菌活性的影響及動力學特性

張宇坤，王淑瑩*，董怡君，顧升波，彭永臻

（北京工業(yè)大學北京市水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室，北京100124）

含鹽廢水的硝化過程常常出現(xiàn)亞硝酸鹽積累，NaCl鹽度對氨氧化菌（AOB）活性的影響與動力學特性并不清楚.采用高濃度氨氮污水富集培養(yǎng)AOB，并成功實現(xiàn)短程硝化.對富含AOB的污泥進行熒光原位雜交技術(shù)（FISH）分析表明AOB占細菌總數(shù)比例為（55±7）%.污泥的最大比氨氧化速率為（0.92±0.13）gN/（gVSS·d）.用此污泥考察了NaCl鹽度對AOB活性的影響，并測定了10g/L時AOB的動力學參數(shù)（KNH3、Ko）.試驗結(jié)果表明，與鹽度為0g/L時的AOB活性相比，鹽度為15g/L時的AOB活性降低了37%；鹽度為30g/L時降低了85%.鹽度為10g/L時，AOB的最大比氨氧化速率為（0.62 ± 0.03）gN/（gVSS·d），底物半飽和常數(shù)KNH3值為（7.62 ± 0.13）mg/L，氧的半飽和常數(shù)Ko值為（0.39 ± 0.04）mg/L，其中KNH3測定值高于ASM2模型推薦值.NaCl鹽度對AOB的抑制降低了最大比氨氧化速率，對底物（NH4+-N）傳遞存在影響.

活性；廢水；動力學；氨氧化細菌；鹽度

隨著淡水資源的緊缺，部分沿海地區(qū)采用海水替代城市生活用水（海水沖廁，消防等）［1-2］，此外，一些人類生產(chǎn)活動（海產(chǎn)品加工廢水，蔬菜腌制等）也會帶來大量的無機鹽［3-4］.含無機鹽的廢水與市政污水混合后進入城市污水處理廠，會對活性污泥產(chǎn)生毒害作用［5］，嚴重影響污水處理廠的正常運行.海水利用產(chǎn)生的污水經(jīng)市政管網(wǎng)最終流入污水處理廠，水量約占污水處理總量的30%，含鹽生活污水的鹽度一般不超過10g/L［6-7］.

硝化過程作為污水生物處理的重要組成部分，含鹽廢水的硝化過程活性（最大比氨氧化速率與鹽度為0g/L時最大比氨氧化速率的比值）低于普通活性污泥法［8-10］.微生物實驗表明［7］，氨氧化細菌（AOB）的存活率（采用most probably number （MPN）計數(shù)法［11］）隨鹽度增高而減小.隨著鹽度的升高，細胞的滲透壓增大，不利于細胞內(nèi)底物、氧的傳遞［12］，這可能是含鹽廢水硝化過程效率低下的原因之一.底物-N）半飽和常數(shù)（KNH3）和氧的半飽和常數(shù)（Ko）是表征AOB的氨氮、氧的傳遞能力的動力學參數(shù).ASM2模型中給出了無鹽度時AOB的KNH3（1mg/L）， Ko（0.5mg/ L）的參考值［13］.目前，針對NaCl鹽度是否會對氨氧化過程中氨氮、氧的傳遞能力（KNH3，Ko）產(chǎn)生影響還鮮見報道.現(xiàn)有的研究在測定硝化菌群的KNH3，Ko值時常采用異養(yǎng)菌為主的活性污泥［14-16］，Manser［14］等測定了普通活性污泥中AOB的KNH3= （0.14 ± 0.1）mg/L， Ko= （0.79 ± 0.08）mg/L；顧升波［16］測定了短程硝化污泥中AOB的Ko= 0.26mg/L，污泥中較低的硝化菌群比例（AOB占全菌比例約3.5～5%）［15-16］，降低了硝化菌群動力學參數(shù)測定結(jié)果的可靠性；對AOB進行富集培養(yǎng)［17-18］有利于提高AOB占全菌比例，本研究以富含AOB的活性污泥（AOB占全菌比例大于50%）為研究對象，減少了異養(yǎng)菌等對動力學測定的影響，可獲得更加準確的AOB動力學參數(shù).目前研究多集中于鹽度對混合菌群的COD氧化能力、硝化效果的影響，關(guān)于鹽度對AOB的活性影響及動力學還未見報道.本試驗擬采用序批式反應(yīng)器（SBR）裝置富集培養(yǎng)AOB，以富含AOB的活性污泥為研究對象，檢測NaCl鹽度對AOB活性的影響，并測定鹽度為10g/L時AOB的最大比氨氧化速率KNH3值，Ko值，分析NaCl鹽度對AOB活性及動力學參數(shù)的影響，為污水處理廠高效處理含鹽廢水提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 氨氧化細菌富集裝置及運行方式

采用有效容積為10L的SBR裝置富集AOB.其中有效容積均為8L，每周期進水2L，排水比為25%；通過溫控裝置控制溫度在22～25℃；溶解氧（DO）控制在2mg/L以上.在每周期開始時和120min時開啟蠕動泵，投加1mol/L的NaOH將 SBR裝置pH值調(diào)節(jié)到7.5～8.0；每周期運行360min：進水（12min），曝氣（300min），沉淀30min，排水12min，閑置6min；污泥齡約為15d.經(jīng)過422d富集培養(yǎng)，最大比氨氧化速率可達0.92gN（gVSS·d）.

1.2 試驗用水水質(zhì)

對于AOB的富集，人工配置污水采用Vadivelu等［18］的配方，采用NH4HCO3（2000mgN/ L）作為無機碳源和氮源；配制污水均添加痕量元素［18］（2mL/L）.配水組成見表1，所有的配水試驗用水都經(jīng)過滅菌后再連入反應(yīng)器；如前所述，耐鹽污泥系統(tǒng)常采用鹽度10g/L作為污泥馴化的上限［6-7］，因此在測定含鹽廢水AOB的動力學參數(shù)時，鹽度（NaCl）均設(shè)定為10g/L.

表1 人工配制污水水質(zhì)情況Table 1 Characteristic of artificial wastewater

1.3 批次試驗

1.3.1 NaCl鹽度對AOB氨氧化活性的影響 NaCl鹽度對AOB氨氧化活性影響的批次試驗共6個批次，鹽度（NaCl）分別設(shè)定為：0，5，10，15，20，30g/L，每個批次包含3組平行試驗.試驗開始前向500mL批次試驗瓶內(nèi)投加碳酸氫銨溶液，氨氮初始濃度為50mg/L.試驗過程中通過投加HCl和NaOH控制pH值為7.2±0.1；控制DO＞4mg/L.批次試驗時間為30min，水樣經(jīng)Millipore 0.45μm濾膜過濾后檢測水樣中-N濃度，混合液懸浮固體濃度（MLSS）約為922mg/L，混合液揮發(fā)性懸浮固體濃度（MLVSS）約為768mg/L.

式中：q為比氨氮氧化速率，mg/（gVSS·h）；qmax為最大比氨氮氧化速率，mg/（gVSS·h）；SNH3為氨氮濃度，mg/L；KNH3為底物-N）半飽和常數(shù)， mg/L.

1.3.3 氧的半飽和常數(shù)的測定 批次試驗共進行12個批次，每個批次設(shè)定不同的DO濃度（0.3～9mg/L）；批次試驗中均提供過量的（遠大于KNH3值）底物-N）：初始-N濃度為30mg/L，每隔5～10min其他條件與底物-N）半飽和常數(shù)試驗條件相同.Ko值采用式（2）擬合DO濃度--氨氧化菌活性進行檢測［19］，

式中：So為溶解氧（DO）濃度， mg/L；Ko為氧的半飽和常數(shù)， mg/L.

1.4 檢測指標及分析方法

氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、MLSS、MLVSS均采用標準方法測定［20］.熒光原位雜交技術(shù)（FISH）采用Amann［21］的操作方法進行，采用4% PFA， 4℃條件下對污泥樣品固定120～180min.對固定后的污泥樣品超聲分散1min，將樣品滴加在明膠包被過的載玻片上，干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脫水3min. 雜交緩沖液組成包括0.9mol/L NaCl、20mmol/L Tris/HCl，0.01% SDS和甲酰胺（甲酰胺FA濃度見表2，pH值為7.2）.將熒光標記的寡核苷酸探針溶解于雜交緩沖液中，在46℃下與污泥樣品雜交120min.采用的寡核苷酸探針列于表2.雜交結(jié)束后，采用洗脫緩沖液在48℃下洗脫20min.在干燥后的樣品上滴加抗熒光衰減液，對每個污泥樣品隨機拍攝20～25張照片（OLYMPUS BX61熒光顯微鏡），并采用Image-pro plus 6.0Software?進行計數(shù)分析；污泥粒徑分布、污泥比表面積檢測采用Beun［22］的操作方法.

表2 所用寡核苷酸探針堿基序列Table 2 Oligonucleotide probes used in this study

2 結(jié)果與討論

2.1 AOB富集裝置典型周期污染物變化情況及污泥分析

由圖1可見，在0～180min氨氮逐漸下降，約170mg/L氨氮被氧化.最大比氨氧化速率為（0.92± 0.13）gN/（gVSS·d），這顯示AOB富集裝置具有很高的氨氧化活性；同時，亞硝態(tài)氮也逐漸增加，0～180min共增加了163mg/L，沒有檢測到硝態(tài)氮.這說明系統(tǒng)中NOB含量較少或活性不高，成功實現(xiàn)了短程硝化，有利于提高AOB占細菌總數(shù)的比例.值得注意的是，在180～300min時系統(tǒng)氨氮濃度仍然較高（530mg/L），且氨氮停止下降，這可能是因為此時的pH值很低（約5.9），生成的亞硝態(tài)氮以游離亞硝酸（FNA最大值約為0.5mg HNO2-N/L）形式存在，抑制了氨氧化過程［17］.由圖1b可見，系統(tǒng)溫度穩(wěn)定在（26±1）℃，pH值在氨氧化過程一直在下降，這是由于氨氧化過程釋放H+.在曝氣120min時用1mol/L的NaOH將反應(yīng)器pH值調(diào)節(jié)到7.5～8.0.當pH值在5.9左右時（第180min）pH值不再下降，這可能是由于氨氧化過程受到FNA抑制［17］，停止釋放H+；DO在140min左右出現(xiàn)突躍點，此時氨氧化速率變?。▓D1a），需氧量下降.對富含AOB的活性污泥進行FISH檢測（圖2），結(jié)果顯示AOB占細菌總數(shù)比例為（55±7）%，Nitrobacer占細菌總數(shù)比例（4±1）%，未檢測到Nitrospira.對AOB富集裝置內(nèi)污泥（第422d）的粒度分布情況進行分析（圖3），可以看出污泥的粒徑主要分布在50～400μm之間，其污泥平均粒徑為163μm，與顧升波［16］培養(yǎng)的AOB污泥粒徑相差不大，但大于Blackburne等［19］富集的NOB污泥粒徑.同時測得該污泥比表面積為0.0577m2/g.

圖1 SBR典型周期（第422d）中氨氮，亞硝態(tài)氮，硝態(tài)氮濃度及參數(shù)變化情況Fig.1 Profile of ammonia， nitrite， nitrate and parameters in typical SBR cycle （the 422d）

2.2 NaCl鹽度對AOB氨氧化活性的影響

圖4顯示了NaCl鹽度對AOB的氨氧化活性（最大比氨氧化速率與鹽度為0g/L時最大比氨氧化速率的比值）的影響.AOB的氨氧化速率隨鹽度（0～30g/L）的增大而逐漸減?。▓D4a），鹽度為0g/L時AOB的最大比氨氧化速率最大，為0.92gN/ （gVSS·d）；鹽度為10g/L時AOB的活性相對0g/L時降低27%；當鹽度增加為30g/L時，AOB的活性降低了85%.對鹽度與AOB活性關(guān)系進行線性擬合，結(jié)果顯示兩者線性關(guān)系良好（圖4b），q/qmax= -2.64X + 100， R2= 0.98.這顯示NaCl鹽度對AOB的活性存在重要影響，鹽度的升高會嚴重抑制AOB的氨氧化活性，這與以往的研究結(jié)果一致［2，6］.Omar等［12］認為高鹽污水提高了胞內(nèi)滲透壓，限制了細胞的物質(zhì)傳輸，這可能是含鹽廢水氨氧化活性下降的原因之一.

圖2 富含AOB系統(tǒng)FISH分析（第422d）Fig.2 The FISH analysis of activated sludge in AOB enrichment system （422d）

圖3 富含AOB系統(tǒng)污泥的粒度分布Fig.3 Volumetric floc size distributions of activated sludge in AOB enrichment system

由圖5可見，隨著氨氮濃度的增加，AOB的活性（比氨氧化速率與最大比氨氧化速率的比值）也逐漸增加. 采用式（1）對底物與AOB活性進行擬合［19］， q/qmax= 100%×SNH3/（7.62+SNH3），最大比氨氧化速率為（0.62 ± 0.03）gN/（gVSS·d）， KNH3=（7.62 ± 0.13）mg/L； R2= 0.95. ASM2模型［13］中AOB的KNH3推薦值為1mg/L，本試驗測得的KNH3值高于ASM2模型推薦值.較高的KNH3值意味著隨著氨氮濃度的降低，最大比氨氧化速率會大幅下降，硝化效率降低，氨氮氧化過程難以進行到底.為了實現(xiàn)含鹽廢水氨氮的達標排放，需要更長的曝氣時間.含鹽廢水提高了氨氧化菌的細胞滲透壓［12］進而對底物的傳遞產(chǎn)生抑制，底物半飽和常數(shù)KNH3值也隨之升高；另一方面，較大的污泥粒徑也會提高硝化菌群的KNH3值［19］.對污泥進行耐鹽馴化可能有助于提高含鹽廢水的硝化效率［7］.

圖4 NaCl鹽度對AOB氨氧化活性的影響Fig.4 Effect of NaCl salinity on activity of AOB

2.4 氧的半飽和常數(shù)的測定

由圖6可見，鹽度為10g/L時，隨著DO濃度的增加，AOB的活性也逐漸增強.當DO濃度增加到1.3mg/L附近， AOB活性達到最大值，此后的AOB活性幾乎都在最大值上下波動.AOB活性與DO濃度關(guān)系擬合相關(guān)性良好（R2=0.96）.最大比氨氧化速率為0.62gN/（gVSS·d）； Ko=（0.39± 0.04）mg/L.ASM2模型［13］中AOB的Ko推薦值為0.5mg/L，與本試驗Ko測定值接近.與鹽度為0g/L相比，NaCl鹽度（10g/L）對AOB的氧的半飽和常數(shù)影響不大.

圖5 AOB活性隨著氨氮濃度的變化規(guī)律（鹽度為10g/L）Fig.5 The variation of activity of enrichment AOB with ammonia

圖6 AOB活性隨DO濃度的變化規(guī)律（鹽度為10g/L）Fig.6 The variation of activity of enrichment AOB with DO

3 結(jié)論

3.1 AOB富集裝置的污泥經(jīng)過422d的富集培養(yǎng)，AOB成為優(yōu)勢菌種，F(xiàn)ISH分析結(jié)果顯示AOB占細菌總數(shù)比例為（55±7）%.污泥平均粒徑為163μm.

3.2 鹽度為0g/L時AOB的最大比氨氧化速率為0.92gN/（gVSS·d）.鹽度為5g/L時，AOB的活性相對0g/L時降低了17%；鹽度增加到20g/L時，AOB的活性降低了62%.

3.3 鹽度為10g/L時AOB的最大比氨氧化速率為（0.62±0.03）gN/（gVSS·d），底物（NH4+-N）半飽和常數(shù)KNH3值為（7.62±0.13）mg/L，氧的半飽和常數(shù)Ko值為（0.39±0.04）mg/L.

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致謝：感謝劉麗在論文修訂、試驗方面給予的幫助和支持.

Effect of NaCl salinity on activity of ammonia-oxidizing bacteria and kinetic characterization.

ZHANG Yu-kun，WANG Shu-ying*， DONG Yi-jun， GU Sheng-bo， PENG Yong-zhen
（Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）

China Environmental Science， 2015，35（2）：465～470

Nitrite accumulation was always observed in the saline wastewater nitrification process， but the effect of NaCl salinity on ammonia-oxidizing bacteria （AOB） activity and kinetic characterization has not been clear. In this study， AOB was enriched in a lab-scale SBR system with high concentration of ammonium wastewater， and the partial nitrification was successfully achieved. The fluorescence in situ hybridization （FISH） analysis showed that AOB accounted for （55 ± 7）% of total bacteria. The maximum specific ammonia oxidation rate was （0.92 ± 0.13）gN/（gVSS·d）. The effect of NaCl salinity on AOB activity was investigated using this mixed culture. The kinetic parameters of AOB （KNH3、Ko） were also measured under NaCl salinity of 10g/L. Results showed that compared with NaCl salinity 0g/L， the activity of AOB decreased 37% under NaCl salinity of 15g/L and decreased 85% under NaCl salinity of 30g/L. When salinity was 10g/L，the maximum ammonia oxidation rate was （0.62 ± 0.03）gN（gVSS·d）， the half-saturation constant for ammonia （KNH3） was（7.62±0.13）mg/L， the half-saturation constant for oxygen （Ko） was （0.39±0.04）mg/L. The KNH3value was higher than recommended value of ASM2model. NaCl salinity could reduce maximum specific ammonia oxidation rate， and also affects the substrate （ammonia） affinity of AOB.

activity；wastewater；kinetics；ammonia-oxidising bacteria；salinity

X703.1

A

1000-6923（2015）02-0465-06

張宇坤（1987-），男，黑龍江哈爾濱人，北京工業(yè)大學博士

2014-02-07

高等學校博士學科點專項科研基金（20111103130002）；北京市科委科技創(chuàng)新平臺項目

* 責任作者， 教授， wsy@bjut.edu.cn

研究生，主要從事污水生物處理方面的研究.