邰曉鵬，臧恒昌

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東　濟(jì)南　250012；2.山東省泰安市中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東　泰安　271000）

HPLC法測定乳痛安口服液中連翹苷的含量

邰曉鵬1，2，臧恒昌1

（1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012；2.山東省泰安市中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東泰安271000）

目的建立乳痛安口服液中連翹苷的含量測定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。方法采用反相高效液相色潽法測定乳痛安口服液中連翹苷的含量，并進(jìn)行一系列方法學(xué)考察。色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×150 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流動相：乙腈-水（25∶75）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：277 nm。結(jié)果連翹苷在0.625～10.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.000 0），乳痛安口服液供試品的穩(wěn)定性以及所建立定量方法的專屬性、重現(xiàn)性、精密度、加樣回收率均符合要求，3個(gè)批次的乳痛安口服液中連翹苷的含量分別為14.78、15.31、15.40 μg·mL-1。結(jié)論所建立的測定方法簡便、穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)、可重復(fù)性好，可以用于乳痛安口服液的質(zhì)量控制。

乳痛安口服液；連翹苷；高效液相色譜法；含量測定；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

乳痛安口服液為泰安市中心醫(yī)院院內(nèi)制劑，是由連翹、黃芩、當(dāng)歸等10余味中藥材組成，具有理氣、散結(jié)、止痛等功效，我院臨床用于乳腺增生、乳腺炎的治療，臨床療效確切可靠。連翹［Forsythia suspensa（Thumb.）Vahl］作為方中君藥，連翹苷是其主要成分之一，原標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層色譜法對其進(jìn)行鑒別，無法滿足該制劑的質(zhì)量控制要求。為更有效的控制該制劑的質(zhì)量，本文參考《中國藥典》2010年版（一部）連翹中連翹苷的含量測定方法［1］，以及文獻(xiàn)報(bào)道的其他中藥復(fù)方制劑中連翹苷含量測定方法［2～5］，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定該制劑中連翹苷的含量，以提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1　儀器與試藥

1.1儀器島津高效液相色譜儀（LC-10A），包括SPD-10 AVP紫外檢測器（日本島津公司）；TG3288型分析天平（上海天平儀器廠）。

1.2試劑與試藥連翹苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110821-200406）；乳痛安口服液（泰安市中心醫(yī)院制劑室，批號：140715、140722、140729）；水為超純水，甲醇、乙腈均為色譜純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm× 150 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流動相：乙腈-水（25 ∶75）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：277 nm；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：20 min；理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。連翹苷的保留時(shí)間為10.01 min，與其他組分分離良好，連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品、乳痛安口服液高效液相色譜圖見圖1、2。

圖1　連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖2　乳痛安口服液高效液相色譜圖

2.2線性關(guān)系考察精密稱取連翹苷對照品適量于標(biāo)準(zhǔn)配制瓶中，加入一定體積甲醇溶解，制得濃度為0.25 mg·mL-1的連翹苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取適量，以甲醇稀釋5倍得50 μg·mL-1連翹苷儲備液。精密吸取上述50 μg·mL-1連翹苷儲備液，分別以甲醇稀釋5倍和10倍，得10 μg·mL-1和5 μg·mL-1的連翹苷儲備液，以該兩種儲備液進(jìn)行適當(dāng)稀釋得濃度0.625、1.25、2.50、5.00、10.00 μg·mL-1的對照品工作溶液。上述工作溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積積分值，并以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=59.079C+2 024.3（回歸系數(shù)r =1.000 0），線性范圍為0.625～10.00 μg·mL-1，具體見表1。

2.3供試品溶液制備精密量取乳痛安口服液5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，振搖，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4專屬性考察取處方中連翹以外的其他中藥，按乳痛安口服液工藝，制得陰性對照品溶液。照供試品溶液的制備方法，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，用于考察乳痛安口服液中連翹苷含量測定方法的專屬性，結(jié)果表明，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，連翹苷保留時(shí)間附近未見明顯色譜峰，表明乳痛安口服液中的其他組分對測定無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3　陰性對照品溶液高效液相色譜圖

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取乳痛安口服液樣品（批號：140415），按“2.3”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，置于室溫下，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、3、6、12、24、48 h進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量10 μL，測定連翹苷峰面積積分值并計(jì)算RSD值為1.95％，表明供試品在室溫放置的48 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.6精密度試驗(yàn)取0.625、2.50、10.00 μg·mL-13個(gè)濃度的連翹苷對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件各重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，測定連翹苷峰面積積分值并計(jì)算RSD值分別為1.89％、1.77％、1.26％，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次乳痛安口服液樣品（批號：140415）5份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣平行測定，進(jìn)樣量10 μL，測定連翹苷峰面積積分值并計(jì)算RSD值為1.58％，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)精密吸取同一已知連翹苷含量的乳痛安口服液2.5mL，共9份，分3組，每濃度3份，分別準(zhǔn)確加入250 μg·mL-1連翹苷對照品溶液100、160、300 μL。按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣平行測定，進(jìn)樣量10 μL，測定連翹苷峰面積積分值并計(jì)算結(jié)果，連翹苷的平均回收率為100.77％，見表1，表明本方法的加樣回收率高，樣品在處理的過程中基本沒有損失，所建立定量方法測得結(jié)果是準(zhǔn)確的。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9樣品的含量測定精密吸取3個(gè)批次的乳痛安口服液各5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量10 μL，測定連翹苷峰面積積分值并按“2.2”項(xiàng)下所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線定量連翹苷含量（每批樣品重復(fù)3份），結(jié)果詳見表2。

表2　乳痛安口服液中連翹苷的含量測定結(jié)果

3　討論

作為我院重要的院內(nèi)制劑，乳痛安口服液具有理氣、散結(jié)、止痛等功效，在我院臨床用于乳腺增生、乳腺炎的治療，療效確切可靠。按中藥復(fù)方組方原理，連翹為乳痛安口服液的君藥，中醫(yī)記載其能清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗腫瘤［6］、抗炎鎮(zhèn)痛［7］、抗菌［8］、抗病毒［9］、抗內(nèi)毒素［10］、清除自由基［11］等藥理作用。其中，連翹苷為連翹的主要成分之一，其可通過抑制MAPK與NF-κB的激活來發(fā)揮抗炎作用［12］。

乳痛安口服液含有多種中藥，對于成分復(fù)雜的中藥復(fù)方體系，通常采用定量檢測中藥復(fù)方中一種或多種有效成分的方法來進(jìn)行中藥復(fù)方的質(zhì)量控制。對于乳痛安口服液，可以通過檢測其主要活性成分連翹苷含量的方法來控制其質(zhì)量。

然而，由于中藥復(fù)方復(fù)雜成分的干擾，需要選擇適當(dāng)?shù)臉悠诽幚矸椒?，以除掉部分雜質(zhì)。曾有文獻(xiàn)［13］使用乙酸乙酯萃取和過中性氧化鋁柱的方法進(jìn)行含連翹苷合劑的處理，該方法雖然能夠除掉大量雜質(zhì)，但操作繁瑣，并且會造成連翹苷的損失［5］。本研究所用方法中，只需要用甲醇沉淀法將藥液中所含的蛋白、多糖等水溶性成分除掉，這些成分可能會損傷反向高效液相色譜柱，處理后的樣品可直接用于進(jìn)樣分析，通過HPLC條件的摸索實(shí)現(xiàn)連翹苷與雜質(zhì)的分離以及連翹苷的含量測定。本方法操作簡便，加樣回收率數(shù)據(jù)顯示樣品處理的過程中幾乎無連翹苷損失，并且簡便、穩(wěn)定、專屬性強(qiáng)、可重復(fù)性好，可以用于乳痛安口服液的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：381-382.

［2］張慶偉，王潤嶺，李惠芬，等.抗病毒口服液中連翹苷的含量測定［J］.中草藥，2001，32（9）：804-805.

［3］孔憲平.清熱解毒口服液中連翹苷的含量測定［J］.中國醫(yī)藥指南，2008，6（22）：171-172.

［4］潘軍.RP-HPLC法同時(shí)測定復(fù)方黃柏液中鹽酸小檗堿、綠原酸和連翹苷的含量［J］.齊魯藥事，2009，28（9）：524-526.

［5］遲芳振，李玲.清熱解毒片中連翹苷的含量測定［J］.醫(yī)學(xué)信息（上旬刊），2011，24（9）：6139-6140.

［6］張明遠(yuǎn)，鄭福祿，栗坤，等.連翹醇提物對H22肝癌小鼠的抑癌作用［J］.中國誤診學(xué)雜志，2008，8（22）：5322-5323.

［7］胡竟一，雷玲，余悅，等.連翹的抗炎解熱作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，23（3）：51-52.

［8］牛新華，邱世翠，邸大琳，等.連翹體外抑菌作用的研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2002，13（6）：342-343.

［9］胡克杰，徐凱建，王躍紅，等.連翹酯甙體外抗病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2001，8（2）：89.

［10］韓雙紅，王玉芬，張居馨，等.連翹敗毒片的抗內(nèi)毒素及免疫調(diào)節(jié)作用研究［J］.天津中醫(yī)藥，2004，21（5）：417-419.

［11］涂秋云，周春山，湯建萍，等.連翹乙醇提取物清除脂自由基和氧自由基的效果［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，34（6）：728-731.

［12］Zhong WT，Wu YC，Xie XX，et al.Phillyrin attenuates LPS-induced pulmonary inflammation via suppression of MAPK and NF-κB activation in acute lung injury mice ［J］.Fitoterapia，2013，90：132-139.

［13］李會勤.清喉咽合劑中連翹苷的含量測定［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，17（3）：51-52.

Determination of phillyrin in Rutong′an Oral Solution by HPLC

TAI Xiao-peng1，2，ZANG Heng-chang1
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Pharmacy，Taian Central Hospital of Shandong Province，Taian 271000，China）

Objective To establish a method for determination of phillyrin in Rutong′an Oral Solution and to develop a new quality standard.Methods An RP-HPLC method was adopted for the determination of phillyrin in Rutong′an Oral Solution.The HPLC conditions were as follows：Diamonsil C18（4.6mm×150 mm，5 μm）column was used with column temperature 25℃；A mixture of acetonitrile-H2O（25∶75）served as mobile phase with flow rate 1.0 mL·min-1；The injection volume was 10 μL；The detection wavelength was 277 nm；The data acquisition time was 20 min and the theoretical plate number of phillyrin was over 3 000.Results The phillyrin showed a good linearity in the range of 0.625～10.00 μg·mL-1（r=1.000 0）.The stability for samples extracted from Rutong′an Oral Solution，as well as the specialization，reproducibility，precision and recovery for the established quantitative method were in line with the requirements.The contents of phillyrin in the 3 batches of Rutong′an Oral Solution samples were 14.78，15.31，15.40 μg·mL-1，respectively.Conclusion The established method was simple，stable with strong specificity and good repeatability，and can be applied for quality control of Rutong′an Oral Solution.

Rutong′an Oral Solution；Phillyrin；HPLC；Determination；Quality standard

R927.2

A

2095-5375（2015）12-0703-003

邰曉鵬，男，研究方向：醫(yī)院制劑檢驗(yàn)、研究，E-mail：1252443436@qq.com

臧恒昌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：多糖類藥物研究、藥品生產(chǎn)工藝優(yōu)化與在線過程分析與過程控制，Tel：0531-88380268，E-mail：zanghcw@126.com