王云，孟立霞，薛白，李東平，夏薛梅，蔡凌云，*

1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州凱里556011

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川雅安625000

黔東南產(chǎn)仙鶴草的原花青素含量和抗氧化能力測(cè)定

王云1，孟立霞1，薛白2，李東平1，夏薛梅1，蔡凌云1，2*

1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州凱里556011

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川雅安625000

本文以黔東南產(chǎn)仙鶴草為材料，測(cè)定其原花青素含量和抗氧化能力，為黔東南產(chǎn)仙鶴草開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。采用微波輔助提取原花青素，通過(guò)紫外分光光度計(jì)，采用鐵鹽催化法測(cè)定原花青素的含量，用DPPH自由基法測(cè)定仙鶴草原花青素的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黔東南產(chǎn)仙鶴草原花青素的含量較高，為236.60 mg/g，對(duì)DPPH自由基的清除率30 μg/mL時(shí)高達(dá)92.85%。黔東南州產(chǎn)仙鶴草原花青素含量和抗氧化能力都較高，開(kāi)發(fā)價(jià)值大。

仙鶴草；原花青素；含量；抗氧化能力

仙鶴草為薔薇科龍芽草屬植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb Var.japonica（Miq.）Nakai的全草。別名脫力草、瓜香草、老牛筋、狼芽草。為多年生草本，高達(dá)1 m，全株具白色長(zhǎng)毛。根莖短，常生1或數(shù)個(gè)根芽（越冬芽）。莖直立，被疏柔毛及腺毛。羽狀復(fù)葉互生，小葉大小不等，間隔排列，卵圓形至倒卵圓形，長(zhǎng)2.5～7 cm，寬1.5～3.5 cm，邊緣有鋸齒，兩面均被柔毛；托葉近卵形?？偁罨ㄐ蝽斏?；花萼倒圓錐形，5裂，裂片基部生多數(shù)鉤狀剛毛，宿存；花瓣5，黃色；雄蕊5～15；子房半下位，花柱突出。萼筒于果熟時(shí)增厚，下垂，頂端有一輪直立鉤刺，外有較深縱溝，極似仙鶴頭部，因而稱仙鶴草?；ü?～12月。我國(guó)南北都有分布［1］。仙鶴草性平，味苦、澀。是良好的收斂止血藥，傳統(tǒng)多用于治療各種出血癥。如咳血，吐血，崩漏下血，瘧疾，血痢，脫力勞傷，癰腫瘡毒，陰癢帶下等癥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草含有多種生理活性成分，如酚類化合物、黃酮類化合物以及糖苷類化合物、三萜類以及揮發(fā)油、甾體類化合物、脂類化合物、有機(jī)酸、鞣質(zhì)類化合物，除此之外，仙鶴草中還含有鐵、錳、銅、鋅、鉀、鍶、鈉、鋁等多種微量元索以及維生素等成分［1，2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明仙鶴草具有止血、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、驅(qū)蟲(chóng)作用；能治美尼爾綜合癥、糖尿??；可做農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。臨床上主要用于治療咳血、吐血、瘧疾、腫瘤等疾?。?-6］。仙鶴草還用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖［7-9］。目前對(duì)于黔東南州產(chǎn)仙鶴草原花青素的提取和含量測(cè)定及抗氧化性能筆者未見(jiàn)國(guó)內(nèi)（外）文獻(xiàn)報(bào)道。原花青素是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑［10，11］。清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，因高效、低毒、高生物利用率而被廣泛用于食品、飲料、化妝品及保健用品等領(lǐng)域，市場(chǎng)應(yīng)用前景非常廣闊。筆者以黔東南州的仙鶴草為材料，結(jié)合研究方向，對(duì)其原花青素進(jìn)行提取和測(cè)定等分析，可為黔東南州仙鶴草的質(zhì)量評(píng)價(jià)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

上海新儀微波化學(xué)科技有限公司MAS-I2型常用微波合成儀，上海亞榮生化儀器廠RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，島津UV-2250紫外分光光度計(jì)，德國(guó)Eppendorf Research移液器；昆山市超聲儀器有限公司KQ3200DE超聲清洗儀，上海亞榮生化儀器廠SHZ-Ⅱ型循環(huán)水真空泵。

1.2 試藥與材料

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，含量≥95%），香草醛、丙酮、甲醇、冰醋酸、乙醚、正丁醇、濃鹽酸均為分析純。蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。仙鶴草購(gòu)于貴州省黔東南州凱里市中草藥市場(chǎng)，經(jīng)凱里學(xué)院蔡凌云教授鑒定為薔薇科多年生草本植物仙鶴草Agrimonia pilosa Ledeb Var. japonica（Miq.）Nakai。

1.3 樣品處理和提取液制備

仙鶴草經(jīng)60℃干燥，打粉，粉末過(guò)100目篩，置于干燥器中備用。

取樣品3.00 g，加30 mL丙酮+水（7：3）浸泡20 min，在40℃600 w條件下微波2 min，過(guò)濾，重復(fù)提取1次，合并濾液，在35攝氏度減壓濃縮至10～20 mL，至無(wú)丙酮味，濃縮液加6 mL乙醚萃取，重復(fù)四次，合并萃取液定容至100 mL，備用。

取樣品3.00 g，加30 mL甲醇+水（7：3），重復(fù)以上提取操作。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用甲醇溶解后，定容于50 mL的容量瓶中，得0.20 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL分別放入1～7號(hào)試管中，按“1. 4”項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，以吸光度值（A）3次的平均值為縱坐標(biāo)，原花青素濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程為：

A=8.0985 C－0.0009 R=0.9996，表明原花青素在0.0054～0.0324 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密吸取一定量的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液分別放入試管中，加甲醇補(bǔ)足體積至1.2 mL，加6 mL正丁醇-濃鹽酸（95：5），加0.2 mL硫酸鐵銨，充分振蕩60℃熱水浴避光反應(yīng)60 min，冰水冷卻至室溫，在400～800 nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液的最大吸收值均在550 nm。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，每隔5 min測(cè)定1次，記錄在60 min內(nèi)的吸光值，A=0.180、0.180、0.179、0.180、0.179、0.179、0.179、0.179、0.178、0.178、0.178、0.178，RSD為0.443%，表明測(cè)定方法穩(wěn)定。

2.4 加樣回收試驗(yàn)

精密吸取“1.3”項(xiàng)下制備的供試樣品溶液10 mL稀釋到100 mL，取0.2 mL，置于10 mL試管，共6份，再分別加入原花青素對(duì)照品溶液1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光值，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，表明測(cè)定方法準(zhǔn)確度好。

表1 加樣回收率Table 1 Recovery percentage of sample

2.5 精密度試驗(yàn)

吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于10 mL試管中，共6份，于最大吸收波長(zhǎng)550 nm下測(cè)定吸光值為0.057、0.057、0.054、0.058、0.057、0.055，計(jì)算RSD為2.68%，說(shuō)明精密度良好。

2.6 樣品中原花青素提取溶劑選擇和含量測(cè)定

取1.3制備樣液按2.2項(xiàng)方法分別測(cè)定吸光值，見(jiàn)表2。結(jié)果表明溶劑為丙酮+水（A=1.550、1.566、1.542）的提取率高于甲醇+水（A=1.354、1.327、1.377），故采用丙酮+水（7：3）為提取溶劑。

取1.3制備樣液0.2 mL（丙酮+水），按2.2項(xiàng)下方法分別測(cè)定吸光值，取3次的平均值代入回歸方程計(jì)算出仙鶴草粉末中原花青素的含量，含量為236.60 mg/g。

2.7 樣品原花青素對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定［12］

取1.3項(xiàng)下制備的提取液（丙酮+水），配制成不同質(zhì)量濃度的仙鶴草原花青素提取溶液（30、60、90、120、150、180 μg/mL），取樣液2 mL加入2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，加塞，搖勻，在25℃避光反應(yīng)30 min，取出，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。用蒸餾水代替DPPH溶液測(cè)定吸光度。仙鶴草原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率見(jiàn)圖1。

圖1 仙鶴草原花青素提取溶液對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1Scavengingratesof procyanidinefromAgrimonia pilosaat differentconcentrationsagainstDPPHfreeradicals

由圖1可知隨仙鶴草原花青素質(zhì)量濃度的增大對(duì)DPPH自由基的清除率增強(qiáng)，但仙鶴草原花青素在很低濃度范圍內(nèi)即對(duì)DPPH自由基有極高的清除率（30μg/mL是清除率為92.85%），差異性分析表明，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，仙鶴草原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明仙鶴草原花青素的抗氧化性能強(qiáng)，低濃度即有好的抗氧化能力，是良好的天然抗氧化劑。

3 結(jié)論與討論

（1）原花青素的提取溶劑可以用丙酮、甲醇等，本研究考察了兩種提取劑對(duì)仙鶴草原花青素提取的影響，結(jié)果表明丙酮+水（7：3）作為提取劑提取率較高。

（2）原花青素含量的測(cè)定方法有香草醛甲醇-濃鹽酸法、鐵鹽催化法等、本研究采用鐵鹽催化法，經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、加樣回收等試驗(yàn)，結(jié)果表明鐵鹽催化法用于仙鶴草原花青素含量測(cè)定準(zhǔn)確可行。

（3）隨著近年相關(guān)研究的發(fā)展，仙鶴草的相關(guān)生物活性不斷被發(fā)現(xiàn)，最典型的是抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫功能、降血壓、鎮(zhèn)痛抗炎等生物活性。仙鶴草的抗腫瘤研究已經(jīng)有了大量的文獻(xiàn)報(bào)道，這些抗腫瘤機(jī)理的研究都很可能利用了仙鶴草活性成分中的抗氧化成分，由此可見(jiàn)仙鶴草是一種極有潛力的天然抗氧化劑中藥和天然藥用植物資源［13-15］。本研究表明黔東南產(chǎn)仙鶴草原花青素含量為236.60 mg/g，在30 μg/mL時(shí)，仙鶴草原花青素對(duì)DPPH自由基的清除率即高達(dá)92.85%，是良好的抗氧化劑。為黔東南產(chǎn)仙鶴草開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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Determination on the Procyanidin Content and Antioxidation in Agrimonia pilosa Ledeb from Qiandongnan

WANG Yun1，MENG Li-xia1，XUE Bai2，LI Dong-ping1，XIAXue-mei1，CAI Ling-yun1，2*
1.College of Environment and Life Science，Kaili University，Kaili 556011，China
2.Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural Universiyt，Yaan 625000，China

This paper determined the procyanidin content and its antioxidation in Agrimonia pilosa Ledeb from Qindongnan so as to provide basis for the development of procyanidin.The vanillin-glacial acetic acid spectrophotometry was used to determine procyanidin content in A.pilosa，The scavenging activities on DPPH free radical were evaluated by spectrophotometry.The experiments results showed that the procyanidin content and antioxidation was higher in A.Pilosa，and the procyanidin content was 236.60 mg/g，DPPH free radical clearance rate was 92.85%（30μg/mL）.The procyanidin content and antioxidation in A.Pilosa from Qiandongnan were higher，so it was a kind of medicinal plants with high value for development..

Agrimonia pilosa Ledeb；procyanidin；content；antioxidation

R284·2

A

1000-2324（2015）01-0047-04

2012-10-23

2013-02-03

貴州省科技廳項(xiàng)目（KJT201101）；凱里學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（ZX201201）；貴州省科技廳項(xiàng)目（黔科合J字［2013］2258）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31201160）

王云（1966-），女，苗，學(xué)士，教授，主要從事苗藥在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究.E-mail：1073580243@qq.com

*通訊作者：Author for correspondence.E-mail：125906640@qq.com