王豪杰 施鞏寧 趙輝 梁冰 車建波 王一

我省是食管癌的高發(fā)區(qū)，研究表明，EGFR和 RhoE均作用于Ras信號(hào)通路，并且兩者在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能分別扮演者癌基因和抑癌基因的角色。有研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細(xì)胞癌體外癌細(xì)胞中，RhoE基因的上調(diào)可以細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，降低癌細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[1]。本研究通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌中RhoE與EGFR的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床其他資料運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，分析兩者之間的相關(guān)性及其與食管鱗癌的惡性程度及轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系。為食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷及預(yù)后提供新的依據(jù)，并為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 本組59例，取材2011年1月-2012年1月本院胸心外科手術(shù)切除的食管鱗癌標(biāo)本為癌癥組，同一患者癌旁>5 cm的正常組織為對(duì)照組，其中男35例，女24例，年齡48～79歲，平均（53.85±6.36）歲；按照2003版國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC標(biāo)準(zhǔn)分期：I期1例，Ⅱ期28例，Ⅲ期27例，Ⅳ期3例；分化程度按高、中、低分化分別為12、34、13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。大體分型：髓質(zhì)型31例、蕈傘型8例、潰瘍型8例、縮窄型6例。所有病例術(shù)前均未行化療、放療、免疫或生物治療，并且均有完整臨床資料以及病理診斷。

1.2 主要試劑 DAB顯色劑、TrizolRNA提取液試劑盒、目的基因引物、β-actin基因引物購(gòu)自上海生基生物科技有限公司，DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription PCR，RT-PCR）

1.3.1.1 RNA的提取 標(biāo)本研磨后，用TaKaRa公司的Trizol試劑和氯仿提取RNA，經(jīng)異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，室溫干燥后加30 μL的DEPC進(jìn)行沉淀。取2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠測(cè)定，另取2 μL稀釋50倍后紫外測(cè)OD 260的吸光度，其余進(jìn)行cDNA合成。

1.3.1.2 cDNA合成 根據(jù)M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）使用說(shuō)明：上述提取的 RNA 4 μL（約 1 μg），Oligo（dT）（5 μM）1 μL，RNase free dH2O 至 6 μL，70 ℃保溫10 min，冰上急冷2 min，離心數(shù)秒使模版RNA/引物的變性溶液聚集與EP管底部。在上述EP管中再加入2μL 5×M-MLV Buffer，0.5 μL dNTP mix（各 10 mM），0.25 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），0.5 μL RTase M-MLV（RNaseH-） 加 RNase free dH2O 至 10 μL，42 ℃，1 h。70 ℃，保溫15 min后冰上冷卻，得到的cDNA保存-20 ℃，并直接用于下一步PCR擴(kuò)增。

1.3.1.3 目的條帶擴(kuò)增 參照試劑盒上的說(shuō)明，按照表1數(shù)據(jù)配制PCR反應(yīng)液。加入后，充分混勻，按表2條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.1.4 瓊脂糖凝膠電泳和圖像分析 取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、2 μL上樣緩沖液、1 μL Syber-green混勻，向2.0%瓊脂糖凝膠孔中點(diǎn)樣，設(shè)定電泳條件：電壓120 V，電流50 mA，電泳后取出凝膠，在紫外燈下觀察并進(jìn)行掃描及拍照，目的基因及β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外燈下的熒光條帶與Maker比較后，顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期相符。分別為RhoE 169 bp；EGFR 341 bp；β-actin 660 bp；見(jiàn)圖1、2。用UVIbland凝膠圖像處理軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物RhoE、EGFR和β-actin的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行分析，并計(jì)算各個(gè)基因的表達(dá)相對(duì)系數(shù)（即目的基因表達(dá)強(qiáng)度/β-actin的表達(dá)強(qiáng)度）。

表1 PCR反應(yīng)液配制數(shù)據(jù)

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

圖1 RhoE mRNA在正常食管組織及不同分化程度的食管鱗癌組織中的表達(dá)水平

圖2 EGFR mRNA在正常食管組織及不同分化程度的食管鱗癌組織中的表達(dá)水平

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較使用t（或t'）檢驗(yàn)，對(duì)于三者或者三者以上之間的比較則應(yīng)用單因素方差分析以及非參數(shù)檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoE與EGFR在食管癌組織及正常組織中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，食管癌組織中RhoE蛋白呈低表達(dá)，EGFR蛋白呈高表達(dá)，見(jiàn)表3。

2.2 RhoE與EGFR基因的表達(dá)與食管鱗癌的臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 RhoE與EGFR表達(dá)水平的高低與食管鱗癌的分化程度、浸潤(rùn)與否、淋巴轉(zhuǎn)移以及病理分期都有著密切的關(guān)系（P<0.001），但是與腫瘤的位置、大小和分型無(wú)關(guān)（P>0.05），見(jiàn)表4。

表3 食管癌組織與對(duì)照組RhoE表達(dá)情況（±s）

表3 食管癌組織與對(duì)照組RhoE表達(dá)情況（±s）

EGFR mRNA蛋白表達(dá)系數(shù)癌癥組（n=59） 0.346±0.241 0.581±0.174對(duì)照組（n=59） 0.673±0.142 0.347±0.136 t/t′值 26.231 7.204 P值 <0.001 <0.05組別 RhoE mRNA相對(duì)表達(dá)系數(shù)

表4 食管鱗癌的病理特征及RhoE、EGFR表達(dá)情況

續(xù)表4

2.3 食管鱗癌組織中RhoE與EGFR表達(dá)的相關(guān)性運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析對(duì)食管鱗癌組織中RhoE與EGFR mRNA的相對(duì)表達(dá)系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示r=-0.812，P<0.01，提示兩者在食管癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

RhoE又稱Rnd3，屬于一種小分子G蛋白[2]；它獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)決定了它許多特異的功能。RhoE在很多腫瘤中都存在異常表達(dá)，并呈現(xiàn)出一定的特異性[3]。研究表明RhoE可以通過(guò)抑制Ras→Raf→MEK→ERK信號(hào)通路的傳導(dǎo)而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。Zhao等[1]發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌體外癌細(xì)胞中RhoE基因表達(dá)的上調(diào)，可以抑制細(xì)胞的增值、降低癌細(xì)胞的侵襲性、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

EGFR屬于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體，EGFR的經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)通路有：PI3K/PDK1/AKT通路、Ras/Raf/MAPK通路、STATs通路、PLCγ/CaMK/PKC通路。EGFR的核內(nèi)信號(hào)通路屬于非經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)通路，此通路啟動(dòng)后，可以使細(xì)胞周期的進(jìn)程加速[4]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤細(xì)胞的增值、侵襲及轉(zhuǎn)移與EGFR表達(dá)水平上調(diào)密切相關(guān)[5]。

由上述各研究結(jié)果可以看出，EGFR和RhoE均作用于Ras傳導(dǎo)通路，但兩者所起的作用不同，甚至在某些方面是恰恰相反的，目前尚沒(méi)有研究證明兩者之間有無(wú)聯(lián)系以及有著怎樣的聯(lián)系。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細(xì)胞癌中，RhoE可能是一個(gè)候選的抑癌基因，并反饋抑制EGFR的高表達(dá)。因此筆者考慮在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中擬通過(guò)基因沉默及過(guò)表達(dá)的方法人為的提高或降低RhoE的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)EGFR的表達(dá)水平，并進(jìn)一步行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)構(gòu)建食管鱗癌動(dòng)物模型。如果實(shí)驗(yàn)成功，將能夠?yàn)檠泳徥彻馨┑陌l(fā)展、提高患者的生存率、充分評(píng)估預(yù)后生存以及為食管癌的臨床治療提供新的思路和方法。

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