創(chuàng)新者：張少君 孫 琦 陳德穎 張凌斐 孫華強(qiáng)

快速檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留技術(shù)

創(chuàng)新者：張少君 孫 琦 陳德穎 張凌斐 孫華強(qiáng)

本文探索了基于渦旋輔助分散液液微萃?。╒DLLME）的新型樣品前處理技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-氮磷檢測(cè)器（GC/FPD）分析，建立同時(shí)檢測(cè)蔬菜中24種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。方法簡(jiǎn)單實(shí)用，僅需一步提取，無需凈化、蒸發(fā)等步驟。實(shí)驗(yàn)考察了影響VDLLME因素，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，VDLLME對(duì)有機(jī)磷的富集倍數(shù)最高達(dá)900多倍；方法在0.5～20μg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.9990）；24種有機(jī)磷檢測(cè)限（LOD）在0.001～0.002 μg/L范圍內(nèi)，定量限（LOQ）在0.005～0.05 μg/L之間，樣品加標(biāo)回收率范圍為71.5％～95.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于9.89％。VDLLME法能夠有效地消除基質(zhì)干擾，減少假陽(yáng)性的檢出率，提高分析的選擇性和檢測(cè)靈敏度，適用于日常的農(nóng)藥殘留痕量分析工作。

有機(jī)磷農(nóng)藥是目前我國(guó)使用量最大的農(nóng)藥，多數(shù)屬于劇毒和高毒類農(nóng)藥，為了有效預(yù)防和處理有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和食品的污染，需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確、及時(shí)的定性定量檢測(cè)。由于農(nóng)藥殘留種類繁多、樣品的組成十分復(fù)雜，不能直接測(cè)定，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理以減少雜質(zhì)的干擾。因此，新的樣品預(yù)處理方法是分析領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的預(yù)處理方法普遍存在操作步驟繁瑣，處理時(shí)間長(zhǎng)、毒害性高等缺點(diǎn)。近年來發(fā)展了多種現(xiàn)代前處理技術(shù)，如固相萃?。⊿PE）、固相微萃?。⊿PME）和超臨界流體萃取（SFE）等。這些前處理技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快捷、毒害性小的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品以及弱極性的目標(biāo)物的選擇性并不理想。

2006年Rezaee提出分散液液微萃取技術(shù)（DLLME），將混合物迅速注入樣品溶液中，形成混濁溶液，即萃取劑在分散劑的作用下形成分散的細(xì)小有機(jī)液滴。由于提取溶劑和樣品溶液的接觸面積相當(dāng)大，可實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的高效萃取。離心后，萃取溶劑與被分析物沉淀分離，再通過色譜法進(jìn)行分析。使用VDLLME對(duì)于蔬菜中有機(jī)磷的預(yù)處理很少有報(bào)道，本文使用VDLLME提取蔬菜中典型的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，氣相色譜-氮磷檢測(cè)器（GC-FPD）分析測(cè)試蔬菜中24種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。測(cè)定的農(nóng)藥參照了農(nóng)業(yè)部年度考核的50多種農(nóng)藥，農(nóng)藥種類涵蓋了敵敵畏、樂果以及毒死蜱等農(nóng)藥，具有一定的代表性。該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，有效降低了背景干擾，提高了分析靈敏度，能夠滿足日常的農(nóng)藥殘留痕量分析工作。

材料和方法

樣品的預(yù)處理

將蔬菜樣品打碎，準(zhǔn)確稱取1.00 g置于帶蓋錐形離心管中，用5mL丙酮（萃取劑）超聲提取30min，經(jīng)8000 rpm離心3min，吸取上清液1000μL，迅速加入10 μL四氯乙烯（分散劑），渦旋30s形成乳濁液，即1000μL丙酮（萃取劑）中含有10 μL四氯乙烯（分散劑），以8000轉(zhuǎn)離心2min，收集下相，經(jīng)微量無水硫酸鈉脫水，進(jìn)入GC/FPD分析。

色譜分析

GC/FPD系統(tǒng)（GC 2010，島津，日本）配備DB-5MS色譜柱（30 m×0.5mm×0.5 μm，安捷倫，美國(guó)）。分流比5.0，進(jìn)樣量為1μL。載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度260℃，檢測(cè)器溫度280℃。柱溫箱采取程序升溫：130℃保持5min，然后以5℃/分鐘到170℃，保持11min，再以5℃每分鐘升溫到280℃并保持3min。

結(jié)果與討論

萃取劑的優(yōu)化

選擇合適的萃取劑是提高富集效率的關(guān)鍵，根據(jù)“相似相溶原理”，萃取劑的性質(zhì)必須與被分析物的性質(zhì)相近，才能保證對(duì)分析物有較高的富集能力，因此萃取劑要求疏水性、難揮發(fā)、密度大，而且能夠在分散劑作用下形成小液滴均勻分散在水相中。ER和EF作為的評(píng)價(jià)萃取能力的指標(biāo)，運(yùn)算公式如下：

其中，Csed是沉淀中分析物的濃度；C0是樣品中被分析物的初始濃度；Vsed是沉積物的體積，Vaq是樣品體積。

為了得到較高的富集因子（EF）和提取回收率（ER），對(duì)常用的萃取劑進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明使用四氯乙烯得到較高的有機(jī)磷回收率，其原因在于四氯乙烯的密度高、水溶解度低。繼而使用四氯乙烯作為萃取劑，進(jìn)而考查了萃取劑的體積，因?yàn)檩腿┑捏w積直接影響該方法的富集因子。萃取劑四氯乙烯的體積從10μL增大到100μL，離心后沉淀的體積也相應(yīng)增大，然而，被分析物的濃度卻隨之降低，相應(yīng)的EF也隨之下降。因此萃取劑的體積既要保證富集因子較高也要保證有足夠的樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。使用5～20 μL的四氯乙烯時(shí)，富集系數(shù)呈快速上升趨勢(shì)，當(dāng)10μL時(shí)EF達(dá)到最大值（圖1 A）。使用溶劑量高于20μL反而降低富集因子，所以10μL的四氯乙烯足以萃取有機(jī)磷。

圖1 （A）萃取劑四氯乙烯使用量對(duì)富集因子的影響；（B）分散劑使用量對(duì)富集因子的影響

分散劑的優(yōu)化

分散劑的作用是將萃取劑分散成細(xì)小的乳狀液滴，分散劑的選擇決定了乳狀液滴的比表面積的大小，萃取劑液滴體積越小，萃取越容易達(dá)到平衡，乳狀液滴的比表面積越大，萃取越容易在短時(shí)間內(nèi)完成。此外，萃取劑在分散劑中的分配系數(shù)要大于在樣品溶液中的分配系數(shù)。加入分散溶劑的作用是除了在DLLME中形成濁化液之外，還能將被分析物轉(zhuǎn)移到沉積相。6種體積的丙酮200 μL、500 μL、700 μL、1000 μL、1500 μL和2000 μL用作分散劑。使用500μL丙酮時(shí)，并不能很好地形成乳濁液，導(dǎo)致EF較低（圖1 B）。當(dāng)丙酮的量達(dá)到1000 μL時(shí)，EF最高，丙酮的量為1500 μL時(shí)，EF明顯下降，因此，使用1000 μL 作為最佳體積。

pH值的影響

調(diào)整溶液的pH值能夠改變分析物在溶液中的電離平衡，從而提高目標(biāo)化合物的萃取效率。由于有機(jī)磷在堿性條件下易水解，實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)酸作為緩沖劑提高檢測(cè)的重現(xiàn)性。通過加入0.1 mol L-1乙酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH1.0到6.0考查pH對(duì)樣品溶液的影響。在pH2的時(shí)候，得到有機(jī)磷的峰面積最大，加入更多的檸檬酸鹽，峰面積反而降低，可能的原因在于酸性的環(huán)境可以加快有機(jī)磷的水解。調(diào)高pH，有機(jī)磷并不能完全轉(zhuǎn)化離子狀態(tài)。因此，pH2為最優(yōu)的選擇。

離子強(qiáng)度對(duì)VDLLME的影響

目標(biāo)化合物在樣品溶液和萃取劑之間的分配系數(shù)受樣品基質(zhì)的影響，因此可以通過向樣品基質(zhì)中加入無機(jī)鹽（如NaCl、KCl等）增加其離子強(qiáng)度，從而增加目標(biāo)化合物在有機(jī)相中的分配系數(shù)，同時(shí)降低萃取劑在水溶液中的溶解度，從而增加沉積相的體積。加入NaCl從0％到20％ （m/v） 到樣品溶液中，當(dāng)濃度達(dá)到5％的時(shí)候，有機(jī)磷的富集因子呈輕微上升趨勢(shì)，進(jìn)而有所下降，這可能是由于離子的存在改變了能斯特?cái)U(kuò)散層的物理特性，從而改變了目標(biāo)物擴(kuò)散到乳狀液滴的速率，進(jìn)而減少了沉淀的量，從而降低了EF。

方法學(xué)驗(yàn)證

有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品的GC-FPD檢測(cè)分析譜圖見圖2，24種有機(jī)磷農(nóng)藥均得到了良好的分離。VDLLMEGC/FPD方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果總結(jié)見表1，由表可見，在0.5～20μg/L的范圍內(nèi)峰面積與濃度的有機(jī)磷之間呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.9990）。24種有機(jī)磷檢測(cè)限（LOD）在0.001～0.002 μg/L范圍內(nèi)（S/N = 3），定量限（LOQ）在0.005～0.05 μg/L之間。數(shù)據(jù)表明VDLLME-GC/FPD法高效、準(zhǔn)確。

實(shí)際應(yīng)用的評(píng)價(jià)

以近幾年食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中農(nóng)藥殘留現(xiàn)象較嚴(yán)重的韮菜作為樣本，進(jìn)行樣品加標(biāo)測(cè)試，進(jìn)一步驗(yàn)證VDLLMEGC/FPD方法的適用性。樣品加標(biāo)回收率范圍為71.5％～95.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于9.89％（表1），樣品中甲拌磷含量為3.64 mg/kg。

結(jié)語(yǔ)

圖2 24種有機(jī)磷農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)GC/FPD色譜圖

表1 有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的VDLLME檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證

使用VDLLME對(duì)蔬菜中的有機(jī)磷進(jìn)行預(yù)處理，此方法不需要特殊的設(shè)備，可以將提取、濃縮、濃縮到一步完成。與傳統(tǒng)的方法相比，樣品的預(yù)處理時(shí)間大大縮短，從樣本收集到檢測(cè)所需的時(shí)間少于30min。此外，檢測(cè)限達(dá)到了納克級(jí)，這說明了本方法的精度較高。經(jīng)過與經(jīng)典的SPE方法比較，本方法可以作為一種更有效的方法用于準(zhǔn)確采集和提取蔬菜中的痕量有機(jī)磷。

張少君 孫 琦 陳德穎 張凌斐 孫華強(qiáng)

威海市疾病預(yù)防控制中心

張少君（1976-）女，高級(jí)工程師，研究方向：分析化學(xué)；通信作者：陳德穎（1966-）副主任技師。

10.3969/j.issn.1001-8972.2015.16.033

威海市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014GNS013）和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014WS0281）