趙 琳陳 瑞龍鼎新陳 鋒▲陳春英

1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽421001；2.國家納米科學(xué)中心中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點實驗室，北京100190

低劑量納米銀暴露致小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的應(yīng)激反應(yīng)

趙 琳1，2陳 瑞2龍鼎新1陳 鋒1▲陳春英2

1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽421001；2.國家納米科學(xué)中心中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點實驗室，北京100190

目的探討納米銀（AgNPs）對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7毒性效應(yīng)的影響，為AgNPs生物安全性的研究提供依據(jù)。方法將不同濃度的AgNPs（0、6.25、12.5、25、50、60、80 μg/ml）和RAW264.7共同培養(yǎng)，8、24 h后采用甲基噻唑基四唑比色法（MTT）測定各組細(xì)胞的活力，選取2.5、5 μg/ml兩個無明顯細(xì)胞毒性的濃度進(jìn)行后續(xù)研究，檢測應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。結(jié)果用2.5、5 μg/ml的AgNPs處理細(xì)胞，24 h后相差顯微鏡下可見AgNPs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且5 μg/ml組的細(xì)胞形態(tài)有明顯改變；8、24 h后ELISA結(jié)果顯示，IL-6無明顯變化，在5 μg/ml的24 h處理組TNF-α表達(dá)有顯著升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的基因和蛋白在5 μg/ml的24 h處理組表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論RAW264.7細(xì)胞暴露于低劑量的AgNPs后表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)，并且與暴露劑量和作用時間呈正相關(guān)。低劑量AgNPs能夠干擾細(xì)胞的正常生理功能，長期暴露可能產(chǎn)生不可逆的損傷，應(yīng)引起高度關(guān)注。

納米銀；低劑量；毒性；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

隨著對納米技術(shù)領(lǐng)域的研究與日俱增，納米材料被廣泛應(yīng)用于幾乎所有的領(lǐng)域，目前市場上的應(yīng)用已超過1000種納米相關(guān)產(chǎn)品［1］。由于納米銀顆粒（AgNPs）具有良好的抗菌性能，在抗菌敷料、涂料、化妝品和醫(yī)療設(shè)備等方面應(yīng)用十分廣泛，AgNPs相關(guān)產(chǎn)品在應(yīng)用中通過與人體密切接觸或環(huán)境釋放，均可經(jīng)呼吸道、皮膚或

消化道等途徑進(jìn)入血液循環(huán)對人體健康產(chǎn)生危害［2］。巨噬細(xì)胞是機體免疫的一道重要防線，它具有吞噬、清除異物和保護(hù)功能，因此，研究AgNPs對巨噬細(xì)胞的影響，對評價納米物質(zhì)的毒性具有十分重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs毒性呈劑量依賴性［3-5］，Tiwari等［6］研究AgNPs對大鼠毒性影響的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在40 mg/kg組表現(xiàn)出明顯遺傳毒性，并認(rèn)為AgNPs劑量＜10 mg/kg是安全的，可以用于生物醫(yī)學(xué)；當(dāng)劑量＞20 mg/kg顯示明顯毒性。在日常生活中所接觸到的產(chǎn)品中AgNPs含量都較低，許多高劑量暴露的實驗室數(shù)據(jù)并不能很好地闡述實際暴露情況，因而，研究較低劑量，非急性毒性發(fā)生劑量時AgNPs的安全性更具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（RAW264.7）來自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。AgNPs（NM-300K）由歐盟第七框架協(xié)議項目提供，儲存于穩(wěn)定劑中。其成分為7％硝酸銨、4％聚氧乙烯甘油三油酸酯和4％Tween 20。RPMIDMEM，胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；0.25％胰酶（Typsin）購自Hyclone；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tet-razolium）MTT試劑盒購自同仁化學(xué)研究所；ELISA試劑盒購自eBioscience公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計；抗體購自Santa Cruz公司；ECL蛋白條帶發(fā)光液購自Thermo Scientific公司；TRIzol及PCR相關(guān)的酶類購自Invitrogen公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：倒置熒光顯微鏡（Olympus，Japan）；CO2培養(yǎng)箱（Sanyo，Japan）；超凈工作臺（Esco，Singapore）；TEM（JEM-200CX，JEOL，Japan）；離心機（Thermo，USA）；酶標(biāo)儀Infinite M200 microplate reader（Tecan，Durham，USA）；Real Time PCR儀（Eppendorf，Germany）等。

1.2 納米銀表征

將AgNPs溶于無菌超純水中，濃度為1 mg/ml，以100W超聲30min，用超純水稀釋至適宜濃度（5～20μg/ml），利用透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行材料表征分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及活力檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，設(shè)試驗組（AgNPs暴露）、陰性對照組（無AgNPs）和空白對照組（無細(xì)胞），均設(shè)6個副孔。待細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，將試驗組每孔加入100 μl不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50、60、80 μg/ml）的AgNPs培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8或24 h。棄上清液，加培養(yǎng)基100 μl/孔，PBS洗一次，輕輕震蕩3 min后傾棄。每孔加入50 μl 2mg/ml的MTT溶液，4 h后終止培養(yǎng)。吸除上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）振蕩10 min，使結(jié)晶顆粒充分溶解。酶標(biāo)儀490 nm進(jìn)行吸光度檢測。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選用對細(xì)胞活性無明顯毒性的AgNPs濃度（分別為2.5、5 μg/ml）作為后續(xù)實驗用的濃度。

1.4 細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)吞

將蓋玻片置于濃硫酸中浸泡并過夜，次日用自來水沖洗，置于無水乙醇中浸泡6 h，用三蒸水沖洗，置于玻璃培養(yǎng)皿中烘干后高壓消毒，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入烘箱烤干。將蓋玻片放入六孔板中，胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)后將細(xì)胞鋪于六孔板。待細(xì)胞貼壁后，分別加入含有不同濃度（0、2.5、5 μg/ml）的AgNPs培養(yǎng)基。24 h后去除培養(yǎng)基取出蓋玻片，PBS洗3次，乙醇梯度脫水后固定。熒光倒置顯微鏡的明場下觀察細(xì)胞形態(tài)，暗場觀察細(xì)胞攝入AgNPs的情況。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度按1×106個/孔接種于六孔培養(yǎng)板上。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度（0、5、10 μg/ml）AgNPs的培養(yǎng)基，以1 μg/ml的脂多糖（LPS）處理細(xì)胞2 h作為陽性對照，以上各溶液每孔加2 ml，每組3復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1500 r/min離心5 min，取上清液待測。按ELISA試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6含量。

1.6 熒光定量PCR

細(xì)胞處理同上，8或24 h后，用PBS洗細(xì)胞3次，每孔中加入1 ml的Trizol，分光光度計測定RNA濃度后，將一定量RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR（SYBR Green）的分析檢測。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列如表1。

表1 PCR引物序列

1.7 免疫蛋白印跡（Western blot）

細(xì)胞處理同上，8或24 h后，棄去上清，用PBS洗3遍細(xì)胞，再加入1 ml PBS，收集細(xì)胞后加入適量的細(xì)胞RIPA裂解液（50～100 μl），約30 min細(xì)胞裂解后進(jìn)行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品與2×上樣緩沖液按1∶1混勻，金屬浴95℃加熱10 min，冷卻后12 000 r/min離心3 min，取上清待用。蛋白樣品在10％SDS-PAGE凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上后，將膜用5％脫脂牛奶室溫封閉2 h，以1∶1000稀釋Actin、HSP70、BiP、chop、PERK、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1、ATF-6α抗體，4℃孵育過夜，相對應(yīng)的二抗以1∶5000稀釋，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光液使條帶顯影，照相分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Origin 9.0軟件將實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AgNPs電鏡觀察結(jié)果

圖1示電鏡檢測結(jié)果，AgNPs為類球形，分散均勻，無團(tuán)聚現(xiàn)象，平均粒徑為（21.8±4.8）nm。

圖1 AgNPs透射電鏡（F20）表征

2.2 不同濃度AgNPs對細(xì)胞活力的影響

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度AgNPs處理8、24 h后，細(xì)胞活性結(jié)果顯示：加入AgNPs后細(xì)胞活力受到不同程度抑制，AgNPs濃度為0～10 μg/ml，細(xì)胞毒性較小，隨著AgNPs濃度增加（≥10 μg/ml），細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著性降低；24 h組細(xì)胞活性下降結(jié)果較8 h組更為明顯，AgNPs對RAW264.7毒性存在明顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系（圖2）。

圖2 不同濃度AgNPs對細(xì)胞活力的影響

2.3 細(xì)胞內(nèi)吞AgNPs作用及形態(tài)學(xué)變化

圖3A、3B、3C為AgNPs進(jìn)入細(xì)胞的光鏡觀察結(jié)果，在特定實驗濃度下，AgNPs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量隨著時間的延長而增加，細(xì)胞形態(tài)也由于AgNPs不斷進(jìn)入而發(fā)生改變。熒光倒置顯微鏡下觀察（圖3D、3E），5 μg/ml的暴露組細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形，細(xì)胞內(nèi)黑色顆粒增多，細(xì)胞間距離變大，細(xì)胞數(shù)量有所減少。

圖3 細(xì)胞內(nèi)吞AgNPs作用及形態(tài)學(xué)變化（光鏡、相差顯微鏡×250）A.正常RAW264.7細(xì)胞；B.AgNPs 2.5 μg/ml組；C.AgNPs 5 μg/ml組；D.AgNPs 2.5 μg/ml組；E.AgNPs 5 μg/ml組

2.4 不同組別炎癥因子變化的比較

圖4所示，LPS陽性對照組的TNF-α和IL-6表達(dá)與對照組比均明顯上調(diào)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（TNF-α：t=27.01，P＜0.01；IL-6：t=7.979，P=0.001）。2.5 μg/ml的AgNPs處理24 h后可見TNF-α明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.138，P=0.035）；5 μg/ml處理24 h后可見TNF-α明顯上升，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.327，P＜0.01）。各濃度AgNPs組IL-6表達(dá)變化都不明顯，與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 不同組別炎癥因子變化的比較A.TNF-α；B.IL-6；與對照組比較，*P＜0.05、**P＜0.01

2.5 不同組別各基因表達(dá)水平的比較

根據(jù)RT-PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果見表2：2.5 μg/ml AgNPs處理細(xì)胞24 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因xbp-1s（t=4.672，P=0.01）、CHOP（t=15.922，P＜0.01）表達(dá)上調(diào)；5 μg/ml的AgNPs處理24 h后，xbp-1s（t=5.959，P=0.004）、CHOP（t=17.041，P＜0.01）表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AgNPs暴露組的炎癥相關(guān)基因IL-6、TNF-α表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。HO1的mRNA表達(dá)在5 μg/ml組的24 h表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.333，P=0.005）。

表2 不同組別各基因表達(dá)水平的比較（±s）

表2 不同組別各基因表達(dá)水平的比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05、**P＜0.01

?

2.6 AgNPs對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5為AgNPs暴露后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BiP、PERK、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1、ATF-6和Caspase-12的變化情況與對照比較，LPS陽性對照ERS的現(xiàn)象最為顯著，AgNPs暴露組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)水平隨著處理濃度和時間的增加而升高。

圖5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)分析結(jié)果

3 討論

近年來，納米毒理學(xué)的研究結(jié)果顯示，一旦物質(zhì)尺寸降至納米尺度將可能產(chǎn)生新的生物效應(yīng)并對人體健康產(chǎn)生危害，具有潛在的風(fēng)險［7］。研究表明，顆粒物粒徑越小越難以被巨噬細(xì)胞清除。巨噬細(xì)胞清除外來異物的能力降低，其吞噬能力也會降低，進(jìn)而對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成影響，對機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生損傷［8］。AgNPs已經(jīng)廣泛應(yīng)用在各類生活用品中，例如燒傷敷料等醫(yī)療產(chǎn)品，評估AgNPs接觸或進(jìn)入人體后的安全性是當(dāng)前預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的一個重要方向。

MTT試驗是檢測細(xì)胞活性和生長狀況的常用方法，本實驗發(fā)現(xiàn)隨著染毒濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞活性逐漸下降，呈濃度依賴關(guān)系。8、24 h組分別在≥50 μg/ml，≥25 μg/ml毒性最為明顯，說明AgNPs能夠能降低RAW264.7細(xì)胞的活性，抑制其生長。為評估低劑量AgNPs對小鼠巨噬細(xì)胞的影響，根據(jù)MTT結(jié)果，選取2.5、5 μg/ml這兩個無明顯毒性的濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

細(xì)胞暴露于納米材料后會引起形態(tài)學(xué)改變［4］，AgNPs處理RAW264.7細(xì)胞24 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察到對照組細(xì)胞無明顯的形態(tài)學(xué)變化，在5 μg/ml AgNPs處理組部分細(xì)胞出現(xiàn)緊貼玻片底部生長，出現(xiàn)細(xì)胞變形、細(xì)胞間隙變大等形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞對納米顆粒的攝取通常有三種機制：吞噬、胞飲、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用［9］。很多研究證實AgNPs和RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)后，AgNPs會被細(xì)胞膜包裹、吞噬進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)以及部分進(jìn)入溶酶體［10-12］，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，

AgNPs與胞內(nèi)的重要生物大分子（如蛋白質(zhì)、DNA）或細(xì)胞器（如線粒體、細(xì)胞核）相互作用引發(fā)一系列變化。本研究利用相差顯微鏡觀察顯示，暴露于AgNPs 24 h后，2.5、5 μg/ml組AgNPs都進(jìn)入細(xì)胞，暗場可見RAW264.7的細(xì)胞輪廓，提示AgNPs在細(xì)胞內(nèi)蓄積。Park等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs對RAW264.7細(xì)胞損害，其主要的毒性機制歸于細(xì)胞對AgNPs的攝取，隨后釋放出銀離子而對細(xì)胞產(chǎn)生損害。有研究表明，AgNPs在細(xì)胞內(nèi)釋放離子的速度比水中快約50倍［11］。

目前對于AgNPs產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機制推測主要存在兩個方面，一是AgNPs直接通過釋放銀離子對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用［14］，另一方面是AgNPs可以通過細(xì)胞融合或是細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激活細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，最終引起細(xì)胞凋亡，甚至壞死［15-16］。炎癥因子作為炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重大作用［8］，本次研究中基因水平IL-6和TNF-α未見明顯上調(diào)趨勢，抗氧化基因HO1明顯上調(diào)。ELISA結(jié)果顯示，IL-6未見有明顯變化，而TNF-α在24 h的2.5、5 μg/ml都有明顯上調(diào)，說明RAW264.7細(xì)胞暴露于低劑量的AgNPs后可產(chǎn)生較微弱的炎癥反應(yīng)。RAW264.7細(xì)胞暴露于AgNPs后，在兩個濃度的24 h組發(fā)現(xiàn)，ERS相關(guān)的xbp-1s基因有上調(diào)的趨勢，在5 μg/ml組還發(fā)現(xiàn)促凋亡的基因CHOP的表達(dá)明顯上調(diào)；在蛋白水平也有同樣發(fā)現(xiàn)，AgNPs暴露組ERS效應(yīng)相關(guān)蛋白BiP、PERK、p-PERK、IRE-1、p-IRE-1、ATF-6、Caspase-12等隨著濃度和時間的增加而表達(dá)明顯上調(diào)。表明AgNPs能使BiP活化，并激活PERK、IRE-1、ATF6三條信號通路，最終引起凋亡相關(guān)蛋白Caspase-12、CHOP的表達(dá)。AgNPs能誘導(dǎo)細(xì)胞的ERS，最終引發(fā)細(xì)胞自噬、凋亡或壞死［17-19］。傳統(tǒng)的毒性學(xué)指標(biāo)大多是細(xì)胞損傷終末期的評判標(biāo)準(zhǔn)，而在AgNPs的應(yīng)用中不能只關(guān)注損傷，更應(yīng)該重視前期應(yīng)激水平的變化。ERS作為細(xì)胞毒性的指標(biāo)，已應(yīng)用于AgNPs誘導(dǎo)人源細(xì)胞和斑馬魚毒性的評價中［20-22］，最近ERS已被作為生物應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞毒理學(xué)早期評價指標(biāo)［23］。本項研究結(jié)果也證實ERS可用作AgNPs暴露后早期敏感的生物學(xué)評價指標(biāo)。

總之，低劑量的AgNPs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，RAW264.7吞噬AgNPs入胞，隨后產(chǎn)生氧化應(yīng)激，在兩個劑量的24 h組，均引起了輕微的炎癥反應(yīng)以及ERS，特別是5 μg/ml組ERS尤為明顯。RAW264.7細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)天然屏障中起重要作用的細(xì)胞，MTT實驗顯示2.5、5 μg/ml對細(xì)胞未見明顯毒性影響，但分子水平的研究卻證實，低劑量暴露仍會引起細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，在長時間暴露時可能導(dǎo)致細(xì)胞形成不可逆的損傷，因而在AgNPs被廣泛應(yīng)用的同時應(yīng)關(guān)注其可能存在的安全問題。

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Stress response of mice macrophage RAW264.7 cell exposed to low dose of silver nanoparticles

ZHAO Lin1，2CHEN Rui2LONG Ding-xin1CHEN Feng1▲CHEN Chun-ying2
1.School of Public Health，University of South China in Hengyang City of Hunan Province，Hengyang421001，China；2.CAS Key Lab for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety，National Center for Nanoscience&Technology of China，Beijing100190，China

Objective To investigate the toxicity of silver nanoparticles（AgNPs）on mice macrophage cell line RAW264.7 and provide the data for understanding their biosafety.Methods Cell viability was determined by the MTT method in RAW264.7 cells after incubation with AgNPs（0，6.25，12.5，25，50，60，80 μg/ml）.The dose of 2.5，5 μg/ml did not cause significant cytotoxicity to RAW264.7 cells，which were used for the following cell treatment to observe the cellular morphology and to determine the protein expression of the stress-related biomarker.The level of TNF-α and IL-6 in the culture medium were determined by ELISA.Results When the RAW264.7 cells were treated with 2.5 and 5 μg/ml of AgNPs for 24-h，the AgNPs were found to be internalized into the cells and cellular morphology were changed apparently in the 5 μg/ml group.The expression of IL-6 did not change after AgNPs treatement for 8 and 24 hours，but the expression of TNF-α was increased in the group after AgNPs treatement for 24-h.Further，the endoplasmic reticulum stress response maker and oxidative-stress protein were upregulated significantly in RAW264.7 cells after 5 μg/ml Ag-NPs treatement for 24-h.Conclusion RAW264.7 cells after exposure to low dose of AgNPs show obvious stress reaction，which is positively correlated with exposure dose and effect time.Low dose AgNPs exposure can disturb the normal cellular physiological function on RAW264.7 cells.Prolonged exposure may cause irreversible damage，should arouse attention.

AgNPs；Low dose；Toxicity；Endoplasmic reticulum stress

R122

A

1674-4721（2015）05（a）-0016-06

2015-04-07 本文編輯：李亞聰）

國家自然科學(xué)基金（21477029）

趙琳（1989-），女，2012級碩士研究生，主要研究方向為納米材料的生物效應(yīng)與安全性

▲通訊作者