裴愛(ài)田

(淄博職業(yè)學(xué)院，山東 淄博255314)

苦楝(Melia azedarach Linn)在中國(guó)分布廣泛，其果實(shí)的產(chǎn)量非常大，川楝素(Toosendanin)是苦楝果實(shí)的主要活性成分之一。川楝素具有驅(qū)蟲、殺蟲等功效，同時(shí)具有非常好的抗肉瘤效應(yīng)，能誘導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡并抑制人和動(dòng)物的多種腫瘤細(xì)胞繁殖［1］。將川楝素應(yīng)用于殺蟲、制藥行業(yè)具有非常重要的意義。目前，苦楝果實(shí)中川楝素的提取方法主要有浸提法［2］、索氏提取法［3］、超聲提取法［4～5］、微波輔助提取法［6］和超臨界 CO2萃取法［7～8］等。超聲提取法具有設(shè)備投資少、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、易于掌握和推廣等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提?。?］。正交試驗(yàn)法是一種有效優(yōu)化提取工藝條件的方法，采用極差分析和方差分析研究各因素之間的相互作用，以較少的試驗(yàn)次數(shù)及較短的時(shí)間對(duì)選擇的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，該方法已廣泛應(yīng)用于生物、化工及食品加工技術(shù)的條件優(yōu)化。裴愛(ài)田［10］對(duì)苦楝素中川楝素的粗提物穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，而利用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取苦楝中川楝素未見(jiàn)報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用無(wú)重復(fù)試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)和極差分析對(duì)超聲法提取苦楝果實(shí)中的川楝素的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)利用苦楝資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)材料苦楝果實(shí)購(gòu)自山東淄博醫(yī)藥商城;川楝素對(duì)照品來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。95%乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。試驗(yàn)儀器KQ-300V超聲波清洗器型(昆山市超聲儀器有限公司);BSA224S-CW電子天平〔賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司〕;FZ-102中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);RV06-ML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó) IKA公司);DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇精密稱取過(guò)40目篩的苦楝果實(shí)粉末6份，每份5 g，分別加入95%乙醇、甲醇、氯仿、水、石油醚、乙酸乙酯100 mL于500 mL三角燒瓶中，置超聲波清洗器中提取。超聲功率300 W，提取時(shí)間10 min，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后定量轉(zhuǎn)移，并用提取劑定容至一定體積，得樣品制備液。樣品制備液經(jīng)液相色譜儀檢測(cè)，計(jì)算川楝素的提取率，根據(jù)提取率選擇合適的溶劑。

1.2.2 川楝素的定量

稱取一定量的川楝素對(duì)照品，用甲醇配制成濃度為 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列，在液相色譜儀上進(jìn)行測(cè)定。

測(cè)定時(shí)的色譜條件為，檢測(cè)器波長(zhǎng)215 nm;C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm);柱溫25℃;流動(dòng)相甲醇水溶液梯度洗脫，甲醇︰水在20 min內(nèi)由40%～100%;流速1mL/min;進(jìn)樣量20μL。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照許海燕等［11］的方法為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以市售苦楝果實(shí)為材料，設(shè)計(jì)4因素4水平的L16(45)正交試驗(yàn)(表1)，研究甲醇濃度、提取時(shí)間、料液比、超聲波功率對(duì)川楝素提取的影響。其中甲醇濃度分別為40%、50%、60%和70%;提取時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min和50 min;料液比分別為1︰5、1︰10、1︰20和1︰30;超聲波功率分別為150 W、200 W、250 W和300 W。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

(1)精密度試驗(yàn) 取川楝素對(duì)照品溶液，按照方法1.2.2設(shè)定的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算川楝素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

(2)重復(fù)性試驗(yàn) 取同一苦楝果實(shí)6份，按照方法1.2.1設(shè)定的條件制備供試液，按照方法

1.2.2設(shè)定的色譜條件分別測(cè)定，測(cè)得川楝素的平均含量，計(jì)算川楝素含量的RSD。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試液，室溫密閉放置，分別在制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h進(jìn)樣，計(jì)算川楝素峰面積的RSD。

(4)加標(biāo)回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取已知含量的苦楝果實(shí)樣品粉末，共9份，分別準(zhǔn)確加入一定量的川楝素對(duì)照品，按照方法1.2.1設(shè)定的條件制備供試液，按照方法1.2.2設(shè)定的色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率及回收率的RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇結(jié)果

6種提取溶劑對(duì)苦楝果實(shí)中川楝素提取率見(jiàn)表2。在相同條件下，不同提取劑對(duì)苦楝果實(shí)中川楝素的提取率有較大的影響，而且提取的成分也不完全相同，用乙醇作提取劑時(shí)，有與川楝素在HPLC儀上難以分開的物質(zhì)被提取出來(lái)，甲醇作提取劑時(shí)，提取液中的川楝素能在1.2.2選定的色譜條件下與樣品中的其他組分很好地分離。因此，選用甲醇作提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對(duì)川楝素提取效率的影響Tab.2 Effect of the toosendanin yield of different solvents

表3 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.3 Results of16(45)orthogonal test

2.2 川楝素最佳提取工藝條件的確定

參照許海燕等［11］的方法，對(duì)苦楝果實(shí)中川楝素提取工藝條件中甲醇濃度、提取時(shí)間、料液比、超聲波功率等4因素4水平正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3中極差R可以看出，對(duì)苦楝果實(shí)中川楝素提取率的影響因素由大到小依次是，甲醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間＞超聲波功率。從產(chǎn)率看，甲醇濃度為70%、提取時(shí)間20 min、料液比為1 g︰30 mL、超聲波功率為200 W時(shí)，川楝素的產(chǎn)率最高，據(jù)此選定該條件組合為超聲波法提取川楝素的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test

經(jīng)方差分析可知，利用超聲波提取法提取苦楝果實(shí)中的川楝素，甲醇濃度對(duì)川楝素提取效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of the recovery test

2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)液相色譜法測(cè)定川楝素精密度試驗(yàn)結(jié)果

川楝素對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次的峰面積依次是223.357、224.078、226.585、228.973、221.264、227.456，其RSD為1.58%，表明該液相色譜法測(cè)定川楝素的精密度良好。

(2)超聲波法提取川楝素重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果同一苦楝果實(shí)中川楝素6次測(cè)定結(jié)果依次是0.32%、0.32%、0.30%、0.31%、0.32%、0.32%，平均含量為0.32%，測(cè)定結(jié)果的RSD為2.66%，表明超聲波法提取苦楝果實(shí)中川楝素的重復(fù)性良好。

(3)川楝素穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試液放置不同時(shí)間后測(cè)得的峰面積依次是118.742、116.578、115.433、114.553、110.256，其 RSD為2.72%，表明川楝素供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

(4)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 苦楝果實(shí)中川楝素加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可知，該方法的平均回收率為96.89%，回收率的RSD為0.99%，符合分析要求。

3 結(jié)論與討論

川楝素具有驅(qū)蛔蟲、蟯蟲和鞭蟲等驅(qū)蟲功效，也是一種植物源殺蟲劑，同時(shí)還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡，抑制人和動(dòng)物的多種腫瘤細(xì)胞繁殖的作用，能夠阻斷突觸前傳遞，抑制多種鉀通道等。本項(xiàng)目在通過(guò)單因素試驗(yàn)選取了對(duì)結(jié)果影響較大的4個(gè)因素，采用正交設(shè)計(jì)和極差分析對(duì)這4個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)利用苦楝資源提供依據(jù)。

(1)本項(xiàng)試驗(yàn)先通過(guò)單因素試驗(yàn)探索超甲醇濃度、提取時(shí)間、料液比及超聲波功率對(duì)苦楝果實(shí)中川楝素提取率的最佳參數(shù)，利用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出了提取苦楝果實(shí)中川楝素的最佳工藝條件為，甲醇濃度70%，固液比1 g︰30 mL，提取時(shí)間20 min，超聲功率200 W。在此條件下，苦楝果實(shí)中川楝素的提取率為0.32%。

(2)本項(xiàng)試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)，具有試驗(yàn)次數(shù)少，能在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行較全面的研究，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的參考價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。

(3)本項(xiàng)試驗(yàn)采用了超聲波提取苦楝果實(shí)中川楝素，該方法具有效率高、能耗少、無(wú)污染、提取成分不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于苦楝果實(shí)中川楝素的提取。

(4)本項(xiàng)試驗(yàn)采用了液相色譜法測(cè)定苦楝果實(shí)中的川楝素含量，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加標(biāo)回收率均良好，表明該方法適合用于苦楝果實(shí)中川楝素的提取和測(cè)定。

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