任紅艷 畢延震 李莉 等

摘要：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)突變小鼠Myostatin基因，為制備MSTN基因修飾豬奠定了理論和實踐基礎。結果表明，成功構建了CRISPR/Cas9定點敲除技術平臺，并獲得MSTN基因發(fā)生缺失突變的小鼠模型。

關鍵詞：CRISPR/Cas9系統(tǒng)；Myostain基因；定點修飾

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5155-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.058

Production of MSTN Gene Mutant Mice Using CRISPR/Cas9 System

REN Hong-yan，BI Yan-zhen， LI Li， ZHENG Xin-min

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： In this paper， Myostatin gene mutant mice were generated using CRISPR/Cas9 system， which can be further applied to preparation of transgenic pigs. The results showed that CRISPR/Cas9 platform was established and MSTN gene mutant mice were generated successfully.

Key words：CRISPR/Cas9 system； Myostatin gene； site-directed mutation

基因敲除動物模型是開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶點的重要工具。傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體選育等步驟，不僅流程繁瑣，對技術的要求很高，而且費用大、耗時較長、成功率也較低。即使對于技術比較成熟的實驗室，利用傳統(tǒng)技術構建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上時間，因此其應用受到限制。新一代人工核酸內切酶（Engineered endonuclease，EEN）的出現，使這一現狀徹底改觀，鋅指核酸內切酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）是第一代人工核酸內切酶，其可以在各種復雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口[1]。截至目前，ZFN已經成功應用于黑長尾猴、大鼠、小鼠、中國倉鼠、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、豬、牛、人類iPS細胞中[2]。第二代人工核酸酶是一類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN），可以和ZFN一樣對復雜的基因組進行精細的修飾，同時其構建較為簡單，特異性更高，因此受到了科研工作者的青睞，在植物、人類細胞、小鼠、斑馬魚、豬、牛中迅速得以應用[3-5]。

2013年，《Cell》雜志報道稱加州大學舊金山分校的研究人員發(fā)現了一種效率更高、修飾更為精確的敲除基因的方法，稱為CRISPR/Cas9系統(tǒng)[6]，該系統(tǒng)因其操作簡單、成本低、效率高等特點受到國內外研究者的關注。CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA[7]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應的CRISPR RNAs（crRNAs）來指導同源序列的降解，從而提供免疫性[8]。該系統(tǒng)的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白質在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計的這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA（short guide RNA），從而引導Cas9對DNA的定點修飾。2013年，美國兩個實驗室報道了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細胞系中進行基因敲除的新方法，利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割導致突變，并迅速將該技術應用于基因敲除小鼠和大鼠的制備中[8，9]。Jaenisch等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在3～4周時間內構建出攜帶5種突變的小鼠，而用傳統(tǒng)的方法則需要3～4年的時間[10]。CRISPR/Cas9技術成為繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細胞打靶和 TALEN 等技術后可構建基因敲除動物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉移能力強等特點，在動物模型的構建中應用前景非常廣闊。

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN），又稱生長分化因子-8，屬于轉化生長因子-β超家族，是骨骼肌發(fā)育的主要負調控因子。MSTN基因通過抑制肌源性調控因子如MyoD等降低成肌細胞的增殖率，并抑制肌細胞分化，MSTN基因缺失的動物表現明顯的雙肌表型[11]。因此，敲除MSTN基因成為提高動物瘦肉率的重要手段。本研究建立了CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因定點修飾技術平臺，并應用該技術制備了MSTN基因突變的小鼠，為后期制備轉基因豬奠定了理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 細菌與質粒

限制性內切酶、dNTP Mix、高保真酶rTaq、pMD-18T載體和T4 DNA連接酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒DNA小量提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌DH5α為湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所生物技術室存留；MLM3613和pDR274載體購自美國Addgene公司；體外轉錄試劑盒mMessagemMachine T7購自Ambion公司，SURVEYOR突變檢測試劑盒購自Transgenomic公司。

1.2 靶位點設計

從NCBI（http：//archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得小鼠MSTN基因組序列，利用ZiFit軟件預測靶位點，選取其中的3個位點。

1.3 Cas9 mRNA的體外轉錄和加尾

1.3.1 Cas9表達載體線性化 Cas9表達載體MLM3613提純后用PmeⅠ酶切線性化。利用PCR產物純化試劑盒回收線性化片段；向回收產物中加入2倍體積無水乙醇和1/10體積NaAc，-20 ℃放置過夜后高速離心回收產物，無RNA酶水溶解產物濃度至500～1 000 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 體外轉錄 利用Ambion公司mMessagemMachine T7 試劑盒進行Cas9 mRNA的體外轉錄和polyA加尾。20 μL體外轉錄體系為：2 μL線性化質粒DNA（1 μg），10 μL 2×NTP/CAP， 2 μL 10×Reaction Buffer，2 μL Enzyme mix，4 μL ddH2O，混勻后37 ℃反應2 h。80 μL polyA加尾體系為：20 μL 5×EPAP Buffer，10 μL MgCl2（25 mmol/L），10 μL ATP（10 mmol/L），4 μL E-PAP，36 μL ddH2O，混勻后37 ℃反應30 min。以1%瓊脂糖凝膠檢測RNA轉錄和加尾情況。

1.4 gRNA編碼載體構建及體外轉錄

根據軟件預測的3個靶序列分別合成序列互補的正、反向引物，在正向引物5端合成TAGG接頭，在反向引物5端合成CAAA接頭，設計模式如圖1所示，合成3個靶序列引物如表1所示。

gRNA體外轉錄載體pDR274載體購自Addgene公司（Addgene No. 42250），將該載體用Bsa Ⅰ酶切線性化后回收，與上面得到的雙鏈產物進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α后提取質粒進行鑒定。將陽性質粒大量提取后用Dra Ⅰ內切酶線性化并回收線性化產物，濃縮濃度至500～1 000 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 小鼠胚胎注射

選取4～5周齡母鼠作為受精卵供體，腹腔注射PMSG和hCG進行超數排卵，交配后取細胞期胚胎進行顯微注射。將Cas9 mRNA（100 ng/μL）和sgRNA（100 ng/μL）混合均勻，注射到細胞期胚胎的胞質內，注射后的胚胎移植到假孕母鼠的輸卵管內。

1.6 敲除小鼠檢測

待移植后的胚胎發(fā)育到13 d時，取出胚胎提取基因組DNA進行錯配內切酶鑒定。具體步驟為：提取基因組DNA，設計引物擴增出靶序列兩側共350 bp片段，純化PCR產物；將純化的PCR產物在95 ℃變性10 min，之后緩慢降溫至室溫使片段重新退火，降溫程序為95℃→85 ℃（每秒降溫2 ℃），85 ℃→25 ℃（每秒降溫0.5 ℃）；重新退火的PCR產物用2 U的T7EI在37 ℃酶切3 h，然后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2 結果與分析

2.1 Cas9表達載體構建與線性化

Cas9表達載體MLM3613質粒經PmeⅠ酶切得到7.5 kb線性化片段（圖2），乙醇沉淀濃度達到1 000 ng/μL，純度高，可以用于下一步體外轉錄試驗。

2.2 Cas9 mRNA體外轉錄結果

Cas9表達載體經酶切線性化后，通過ABI公司的體外轉錄試劑盒進行轉錄，得到了帶有帽子結構的Cas9 mRNA，并通過酚仿抽提得到純化的mRNA。結果（圖3）表明，轉錄的mRNA呈現明顯的兩條帶，為RNA的不同結構，純度較高，可用于下一步加尾試驗。

2.3 加polyA尾后得到全長mRNA序列

將體外轉錄出的mRNA通過polyA Tailing Kit試劑盒進行加尾，加上長度約150 bp的polyA尾巴，使之成為完整的有功能的mRNA。結果（圖4）表明，加尾后的mRNA在電泳時出現了適當的滯后，polyA加尾成功。

2.4 敲除小鼠檢測

待孕母鼠懷孕13 d時取出30只胚胎，提取其基因組DNA。用Transgenomic公司的SURVEYOR突變檢測試劑盒進行突變檢測。結果表明，PCR擴增出T1靶位點兩側473 bp序列，靶序列兩側序列分別為322 bp和151 bp。當序列內部存在堿基突變時，退火后形成的雜合雙鏈能夠被酶切開，形成3條帶（圖5樣品10）；當不存在堿基突變時，退火形成的雙鏈不存在堿基錯配，不能被酶切開，30個樣品中共檢測出2只為突變陽性。

3 小結與討論

本研究獲得的Cas9和gRNA表達載體，為下一步進行相關研究提供了試驗材料；建立了CRISPR/Cas9基因定點修飾技術平臺，為轉基因小鼠和轉基因豬的制備奠定了技術基礎，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得了MSTN基因敲除小鼠。

基因敲除動物模型一直是在活體動物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標的重要工具。但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、技術要求高，而且費用大、耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術比較成熟的實驗室，利用傳統(tǒng)技術構建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上時間。本研究通過體外轉錄和顯微注射等方法在較短時間內獲得了MSTN基因敲除的小鼠，從時間、成本等方面節(jié)約了大量資源，也為下一步進行大動物轉基因研究奠定了基礎。但是從檢測的結果來看，效率并不高，30只小鼠中只檢測到2只陽性。分析原因可能是：①RNA顯微注射過程中RNA降解問題。RNA很不穩(wěn)定，容易受到外界環(huán)境中RNA酶的降解而失效，在進行中RNA裸露在環(huán)境中的時間較長，且溫度無法控制到很低，導致RNA降解嚴重；②檢測方法靈敏度較低。本研究應用的是SURVEYOR檢測方法，該方法對試驗條件要求特別嚴格，酶添加量及酶切時間長短都會嚴重影響試驗結果，導致試驗結果不穩(wěn)定，重復性差，只能通過大量克隆測序來解決。

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