喻蔚 周穎 周有祥 等

摘要：利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）建立了一種對(duì)嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）進(jìn)行快速檢測(cè)的方法?；谑人畾鈫伟鷗bpA基因，設(shè)計(jì)了一套引物，并優(yōu)化了反應(yīng)體系的溫度、時(shí)間和Mg2+濃度，分析了該方法的特異性與靈敏度。結(jié)果表明，在59 ℃條件下，LAMP的最適擴(kuò)增時(shí)間為40 min，能有效檢測(cè)到1 pg/？滋L核酸濃度，且檢測(cè)出嗜水氣單胞菌為陽性，其他菌株為陰性，該方法耗時(shí)短，靈敏度高，特異性好，適合嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）；tbpA基因；快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）20-5125-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.051

Study on the Rapid Detection of Aeromonas hydrophila by

Loop-mediated Isothermal Amplification

YU Wei1a，ZHOU Ying1b，ZHOU You-xiang2，LIN Li1a，ZHOU Yang1a

（1a.College of Fisheries；1b.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China；2.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064， China）

Abstract： LAMP （Loop-mediated isothermal amplification） as a kind of rapid detection method for Aeromonas hydrophila was established. A set of primers were designed based on the sequences of the tbpA gene of A. hydrophila. Temperature， time， Mg2+ concentration of reaction system were optimized， and detected the specificity and sensitivity of this method. The results showed that under 59 ℃， the LAMP amplification optimum time for 40 min， this method could effectively detect the nucleic acid concentration with 1 pg/μL， and the LAMP of A. hydrophila reactions was positive， others were negative. In a conclusion， the LAMP detective method was short time-consuming， sensitivity and specificity； and it was suitable for rapid detection of A. hydrophila.

Key words： Aeromonas hydrophila； LAMP； tbpA gene； rapid detection

嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界中，能在水體及土壤中生長繁殖[1]，是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌[2]。嗜水氣單胞菌已被證實(shí)為腹瀉病原菌[3]，可引起人類急性胃腸道感染和食物中毒，出現(xiàn)腹痛、腹瀉、發(fā)熱、急性胃腸炎等[4，5]，給人類的健康帶來了威脅。而國外早已將嗜水氣單胞菌納入腹瀉病原菌的檢測(cè)范圍，是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的對(duì)象[6]。嗜水氣單胞菌可感染草魚、鯽魚、鰱魚、團(tuán)頭魴、黃顙魚等多種淡水魚，并引起水產(chǎn)養(yǎng)殖中的鰻紅鰭病、鱉赤斑病、羅非魚腐皮病[7，8]。從20世紀(jì)90年代起，全國各地爆發(fā)性魚病案例中分離出的致病菌中，嗜水氣單胞菌所占比例越來越大。2006年，全國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)因病害造成的損失約為115億元[9]，而嗜水氣單胞菌是各種病原菌中危害最大的，其使得養(yǎng)殖魚類在短短幾天中大量死亡，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。故嗜水氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)有著極大的威脅。

因此，建立嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)方法對(duì)食品安全和水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。目前，嗜水氣單胞菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括細(xì)菌分離、培養(yǎng)、生理生化試驗(yàn)和血清鑒定等步驟，至少需要3～5 d時(shí)間[10]，不僅耗時(shí)長、步驟多，還容易出現(xiàn)漏檢等問題。此外，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法、免疫熒光抗體和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法等檢測(cè)方法[11，12]，也都存在操作復(fù)雜、敏感性和特異性差等缺點(diǎn)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本學(xué)者Notomi[13]于2000年發(fā)明的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。該技術(shù)通過針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域而設(shè)計(jì)4種特異引物，在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶作用下進(jìn)行的一種自動(dòng)鏈置換DNA 合成反應(yīng)，Nagamine[14]發(fā)現(xiàn)通過添加環(huán)引物，可大大加快反應(yīng)速度。該技術(shù)在恒溫下就可進(jìn)行核酸擴(kuò)增[15]，通常反應(yīng)在1 h內(nèi)完成。本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)tbpA基因在嗜水氣單胞菌中高度保守，不存在于其他菌種中。故建立基于嗜水氣單胞菌tbpA基因的LAMP技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)嗜水氣單胞菌，同時(shí)也可為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌J1為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉永杰教授饋贈(zèng)，乳鏈球菌、枯草芽孢桿菌、噬熱脂肪芽孢桿菌、噬熱液化芽孢桿菌購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

細(xì)菌基因組提取試劑盒為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，Bst DNA聚合酶大片段及ThermoPolTm Reaction Buffer為New England Biolabs公司產(chǎn)品，SYBR Green I為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，dNTPs為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，MgCl2為Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），PCR儀（ProFlexTM公司），Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)嗜水氣單胞菌ML09-119的tbpA基因選取保守性較高的一段序列，利用專門設(shè)計(jì)LAMP 引物的在線設(shè)計(jì)軟件[Primer Explorer Version 3（http：//primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html）]設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)引物。所得引物序列，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.2 基因組的提取 應(yīng)用細(xì)菌基因組提取試劑盒（康為世紀(jì)公司）提取細(xì)菌基因組，提取的基因組保存于-20 ℃，待用。

1.3.3 LAMP方法的優(yōu)化 Mg2+濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)于反應(yīng)的靈敏性和特異性均有影響，因此采用控制變量法優(yōu)化Mg2+濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。LAMP 反應(yīng)體系包括：1 ？滋L 0.8 μmol/L FIP，1 ？滋L 0.8 μmol/L BIP，0.25 ？滋L 0.1 ？滋mol/L F3，0.25 ？滋L 0.1 ？滋mol/L B3，1 ？滋L 0.4 μmol/L LB，1 ？滋L 0.4 μmol/L LF，1.5 ？滋L 0.6 mmol/L dNTPs，2 ？滋L 4 mmol/L MgCl2（除優(yōu)化Mg2+濃度時(shí)），10 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），10 mmol/L（NH4）2SO4，0.5 ？滋L DNA模板，0.2 ？滋L Bst DNA鏈置換聚合酶，最后用滅菌去離子水補(bǔ)足至25 ？滋L。

1）反應(yīng)溫度的優(yōu)化。保持反應(yīng)體系內(nèi)各組分濃度不變，反應(yīng)時(shí)間為40 min。選擇57、59、61、63、65和67 ℃ 6個(gè)不同的反應(yīng)溫度，在同樣的反應(yīng)條件下，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上110 V電泳分離30 min，觀測(cè)結(jié)果。并向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 ？滋L稀釋10倍的SYBR Green I熒光染料，在254 nm處紫外光照射下觀察其熒光強(qiáng)度。

2）反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 保持反應(yīng)體系內(nèi)各組分濃度不變，反應(yīng)溫度為59 ℃。選擇10、20、30和40 min不同的反應(yīng)時(shí)間，在同樣的反應(yīng)體系下，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上110 V電泳分離30 min，觀測(cè)結(jié)果。并向產(chǎn)物中加入1 ？滋L稀釋10倍的SYBR Green I熒光染料，在365 nm處紫外光照射下觀察其熒光強(qiáng)度。

3）Mg2+濃度的優(yōu)化。保持反應(yīng)體系內(nèi)除Mg2+濃度外各組分濃度不變，反應(yīng)溫度為59 ℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min。選擇反應(yīng)體系內(nèi)Mg2+終濃度分別為0、0.16、0.32、0.48和0.64 mmol/L。在同樣反應(yīng)條件下，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上110 V電泳分離30 min，并觀測(cè)結(jié)果。

1.3.4 LAMP特異性試驗(yàn) 應(yīng)用已優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系，在同樣的反應(yīng)條件下，同時(shí)對(duì)乳鏈球菌、枯草芽孢桿菌、噬熱脂肪芽孢桿菌、噬熱液化芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上110 V電泳分離30 min，并觀測(cè)結(jié)果。

1.3.5 LAMP靈敏度試驗(yàn) 將嗜水氣單胞菌基因組模板依次稀釋為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL。應(yīng)用于已優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系，同反應(yīng)條件下對(duì)不同濃度的嗜水氣單胞菌基因組進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上110 V電泳分離30 min。向產(chǎn)物中加入1 μL稀釋10倍的SYBR Green I熒光染料，在365 nm處紫外光照射下觀察其熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)溫度為57、59、61 ℃時(shí)，均能擴(kuò)增tbpA基因，得到條帶。向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I熒光染料后，59 ℃條件下擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度明顯高于57、61 ℃反應(yīng)下的擴(kuò)增產(chǎn)物。故說明最適反應(yīng)溫度為59 ℃（結(jié)果見圖1）。

2.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

結(jié)果如圖2所示，在10、20 min條件下無擴(kuò)增條帶，而在30、40 min條件下均可得到梯型條帶。向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I熒光染料后，40 min條件下擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度明顯高于 30 min的擴(kuò)增產(chǎn)物。故說明最適反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.3 Mg2+濃度的優(yōu)化

電泳結(jié)果如圖3所示。加入2、3、4 μL Mg2+時(shí)均可得到梯型條帶，且條帶亮度差異不大，考慮到試驗(yàn)成本，加入2 μL即LAMP體系內(nèi)Mg2+終濃度為0.32 mmol/L為最優(yōu)條件。

2.4 LAMP特異性試驗(yàn)

對(duì)乳鏈球菌、枯草芽孢桿菌、噬熱脂肪芽孢桿菌、噬熱液化芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌的擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。只有嗜水氣單胞菌出現(xiàn)梯型條帶，呈陽性反應(yīng)，其他非嗜水氣單胞菌菌株檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.5 LAMP靈敏度試驗(yàn)

將嗜水氣單胞菌基因組模板稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)熒光染料染色后，可觀察到各個(gè)濃度下的擴(kuò)增產(chǎn)物均有明顯的熒光，結(jié)果如圖5所示。經(jīng)電泳檢測(cè)，在1 pg/μL時(shí)依然可以得到梯型條帶，說明LAMP檢測(cè)方法靈敏度高。

3 討論

嗜水氣單胞菌是一類廣泛存在于自然界的人-畜-魚共患病病原菌，不僅在食品安全上對(duì)人類健康造成威脅，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)也帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)嗜水氣單胞菌的檢測(cè)在動(dòng)物疾病和食品衛(wèi)生研究上都具有重要意義。

通過生物信息學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)tbpA基因在嗜水氣單胞菌中高度保守，在其他菌種中卻沒有發(fā)現(xiàn)。故本試驗(yàn)基于tbpA基因建立一種LAMP方法以達(dá)到快速檢測(cè)嗜水氣單胞菌的目的。

本試驗(yàn)通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)LAMP體系內(nèi)Mg2+終濃度為0.32 mmol/L，59 ℃反應(yīng)40 min為該方法的最優(yōu)化條件。通過特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。只有嗜水氣單胞菌在該方法下擴(kuò)增出現(xiàn)梯型條帶，呈陽性反應(yīng)，而其他非嗜水氣單胞菌菌株檢測(cè)結(jié)果均為陰性，可檢測(cè)到核酸濃度為 1 pg/μL，說明該方法具有較高的靈敏度。

本試驗(yàn)利用LAMP技術(shù)建立的快速檢測(cè)方法，在保證靈敏性和特異性的前提下，簡(jiǎn)化了操作步驟，大大節(jié)省了時(shí)間和成本，通過瓊脂糖凝膠電泳法和熒光染色法均可判斷結(jié)果，該方法為開發(fā)適用于基層的快速水產(chǎn)品中的嗜水氣單胞菌檢測(cè)方法提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] YUCEL N，ERDOGAN S. Virulence properties and characterization of aeromonads isolated from foods of animal origin and environmental sources[J]. J Food Prot，2010，73（5）：855-860.

[2] 付喬芳，邱軍強(qiáng)，胡 鯤，等.嗜水氣單胞菌毒力基因在傳代過程中的穩(wěn)定性研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011（9）：130-135.

[3] 黃 艷，韋小瑜，王定明，等.一起嗜水氣單胞菌引起的食物中毒調(diào)查[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2012，24（4）：391-393.

[4] 王琳娜.嗜水氣單胞菌感染導(dǎo)致群體性腹瀉的病原學(xué)分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，5（17）：922-923.

[5] 趙曉艷，蘇領(lǐng)彥，王明良.北京市某敬老院一起食源性嗜水氣單胞菌急性胃腸炎暴發(fā)調(diào)查[J].職業(yè)與健康，2014，30（4）：521-523.

[6] 楊守明.嗜水氣單胞菌及其對(duì)人的致病性[J].疾病控制雜志，2006，10（5）：511-514.

[7] 陳懷青，陸承平.嗜水氣單胞菌：黃鱔出血性敗血癥的病原[J].中國人獸共患病雜志，1991，7（4）：21-23.

[8] 陳愛平，朱澤聞，王立新，等.2006年中國水產(chǎn)病害檢測(cè)報(bào)告[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2007（7）：48-49.

[9] 肖克宇，江為民，彭順平，等.中華鱉暴發(fā)性死亡癥的病原及防治研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24（1）：67-71.

[10] 夏 凡，楊麗君，王 靜，等.病原性海洋弧菌致病機(jī)理及其快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（1）：366-376.

[11] SUBASHKUMAR R， THAVUMANAVAN T， VIVEKANANDHAN G， et al . Occurrence of Aeromonas hydrophila in acute gasteroenteritis among children [J]. Indian J Med Res， 2006， 123（1）： 61-66.

[12] 肖婧凡，王 玥，張?jiān)d，等.海水養(yǎng)殖細(xì)菌性病害檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國工程科學(xué)，2014，16（9）：10-15.

[13] NOTOMI T. Loop-mediated isothermal amplification[J]. Nip-pon Rinsho，2007，65（5）：957-961.

[14] NAGAMINE K，HASE T， NOTOMI T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Mol Cell Probe，2002，16（3）：223-229.

[15] 黃火清，郁 昂.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)，2012，22（3）：90-94.