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        疏水離子液體中生物不對稱還原制備手性醇

        2015-11-11 06:02:24穆曉清
        生物加工過程 2015年2期
        關(guān)鍵詞:雙相底物產(chǎn)率

        宋 潔,穆曉清,王 棟,徐 巖

        (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

        疏水離子液體中生物不對稱還原制備手性醇

        宋 潔,穆曉清,王 棟,徐 巖

        (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

        針對近平滑假絲酵母全細(xì)胞不對稱還原2-羥基苯乙酮制備光學(xué)純(R)-苯基乙二醇反應(yīng)中底物的質(zhì)量濃度、產(chǎn)量及質(zhì)量平衡低的問題,運用多相萃取生物轉(zhuǎn)化的原理,比較不同非水介質(zhì)對不對稱還原反應(yīng)效率的影響,構(gòu)建具有良好生物相容性和高質(zhì)量平衡的水/疏水離子液體1-丁基-3-乙基咪唑六氟磷酸鹽([BEIM]PF6)雙相反應(yīng)體系??疾煸擉w系下輔助底物種類、輔助底物用量、底物質(zhì)量濃度、催化劑用量、離子液體比例、pH和反應(yīng)溫度對生物催化反應(yīng)的影響,通過正交試驗設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化不對稱還原2-羥基苯乙酮的反應(yīng)條件,在最優(yōu)反應(yīng)條件下,產(chǎn)物質(zhì)量濃度、產(chǎn)率和質(zhì)量平衡得率分別達(dá)到15.35g/L、76.8%和84.3%,產(chǎn)物的對映消旋值(e.e.值)大于99.9%。

        不對稱還原;全細(xì)胞;(R)-苯基乙二醇;離子液體;質(zhì)量平衡

        (R)-苯基乙二醇((R)-PED)作為一種重要的手性砌塊,是制備多種生物活性化合物的重要中間體[1-2],同時也是液晶中不可缺少的手性添加劑。利用傳統(tǒng)化學(xué)方法合成手性醇,存在合成步驟復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)選擇性低、產(chǎn)物分離困難和環(huán)境污染等缺點[3-4]。而生物合成手性醇方法則有反應(yīng)條件溫和[5]、反應(yīng)立體選擇性高、區(qū)域選擇性高和化學(xué)選擇性高[6-7]、環(huán)境友好等優(yōu)點,符合原子經(jīng)濟(jì)、綠色化學(xué)的發(fā)展方向。

        手性生物合成法催化劑主要以游離酶或全細(xì)胞參與反應(yīng)。全細(xì)胞催化劑具有使用便捷、易于回收、能夠重復(fù)利用等優(yōu)點,其作為氧化還原反應(yīng)催化劑時,可以通過添加廉價的輔助底物,利用細(xì)胞內(nèi)輔酶體系為還原反應(yīng)提供還原型輔酶,同時酶存在于天然的細(xì)胞環(huán)境中不易失活、穩(wěn)定性好。

        但生物合成法存在底物難溶、產(chǎn)物濃度低等缺點,運用多相萃取技術(shù)向反應(yīng)體系中加入非水介質(zhì),能夠增加底物溶解度、降低底物對催化劑的毒害作用,實現(xiàn)產(chǎn)物濃度的提高。離子液體(ILs)作為一種環(huán)境友好型的綠色反應(yīng)介質(zhì),對多數(shù)疏水性化合物溶解性良好[8],具有穩(wěn)定性好、不易揮發(fā)、生物相容性好等優(yōu)點[9-10],可以有效提高反應(yīng)速率和產(chǎn)物的光學(xué)純度[11-12]。

        本研究中,筆者使用所在實驗室保藏的1株近平滑假絲酵母Candida parapsilosis JNYX全細(xì)胞作為生物催化劑,以不對稱還原2-羥基苯乙酮(2-HAP)制備(R)-PED為模式反應(yīng),經(jīng)比較不對稱還原反應(yīng)在不同體系下的催化效果選擇綠色溶劑離子液體(ILs)作為反應(yīng)介質(zhì),并篩選到疏水性離子液體1-丁基-3-乙基咪唑六氟磷酸鹽([BEIM]PF6)構(gòu)建水/[BEIM]PF6雙相反應(yīng)體系,以考察該體系下反應(yīng)條件并進(jìn)行優(yōu)化,以提高反應(yīng)的底物濃度、產(chǎn)率和反應(yīng)質(zhì)量平衡以及催化劑在雙相反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性,為生物合成手性醇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌種

        近平滑假絲酵母Candida parapsilosis JNYX為筆者所在實驗室保藏菌種。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        酵母培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L,酵母浸膏5g/L,無機(jī)鹽溶液10%(體積分?jǐn)?shù))。pH 7.0。

        無機(jī)鹽溶液(g/L):(NH4)2HPO413,KH2PO47,MgSO4·H2O 0.8,NaCl 0.1。

        1.1.3 主要試劑及儀器

        2-羥基苯乙酮(2-HAP),日本TCI公司;離子液體[BEIM]PF6,中國科學(xué)院蘭州物理化學(xué)研究所;其他離子液體由浙江大學(xué)吳起老師提供。

        高效液相色譜P680(紫外檢測器),美國Dionex公司;Chiralcel OB-H色譜柱(4.6mm×250mm),日本Daicel公司。

        1.2 菌體培養(yǎng)

        種子培養(yǎng) 從斜面接兩環(huán)菌種,接種到裝液量為20%(體積分?jǐn)?shù))的250mL三角瓶中,置于150r/min的搖床中30℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

        菌種培養(yǎng) 以2%的接種量將種子液接種至裝液量為 20%的 500mL三角瓶中,于 30℃、150r/min搖床上培養(yǎng) 48 h。發(fā)酵結(jié)束后,于 4℃、12 000r/min離心,并用生理鹽水洗滌2次后收集細(xì)胞,4℃下保存待用。

        1.3 不對稱還原反應(yīng)

        2mL反應(yīng)體系,加入0.5g濕菌體、20g/L 2-HAP、0.4g葡萄糖,30℃、200r/min反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)液離心(12 000r/min),上清液用乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯相用于HPLC檢測。

        1.4 水/[BEIM]PF6雙相體系反應(yīng)條件的優(yōu)化

        通過正交試驗設(shè)計對輔助底物種類、輔助底物用量、底物質(zhì)量濃度、催化劑用量、ILs比例、pH和反應(yīng)溫度7個因素進(jìn)行優(yōu)化,試驗設(shè)計為L18(37),30℃、200r/min反應(yīng)24 h,HPLC檢測反應(yīng)結(jié)果。

        對正交試驗設(shè)計中影響較為顯著的因素使用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化,使用響應(yīng)面分析軟件Design Expert設(shè)計實驗方案,HPLC檢測反應(yīng)結(jié)果。

        1.5 水/[BEIM]PF6雙相體系中催化劑穩(wěn)定性研究

        在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行重復(fù)批次實驗,反應(yīng)24 h離心收集菌體(4℃、12 000r/min,10min),用生理鹽水洗滌2次,相同條件下進(jìn)行下一批次反應(yīng)。

        1.6 分析方法

        乙酸乙酯萃取樣品,采用HPLC分析,色譜柱為Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25mm;Daicel),流動相為正己烷/異丙醇(體積比 9∶1),流速 0.4mL/min,柱溫38℃,紫外檢測器,檢測波長215 nm。(S)-PED和(R)-PED的出峰時間分別為19.5min和23.5min,2-HAP出峰時間為27.5min。

        (R)-PED光學(xué)純度計算見式(1)。

        (R)-PED得率計算見式(2)。

        反應(yīng)質(zhì)量平衡收率計算見式(3)。

        式中:cS、cR分別為反應(yīng)結(jié)束后(S)-PED和(R)-PED的濃度,c0為2-HAP的濃度,cH為反應(yīng)結(jié)束后剩余2-HAP濃度。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 反應(yīng)體系對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        近平滑假絲酵母通常不對稱還原2-HAP生成(S)-PED,本研究室從保藏的近平滑假絲酵母中篩選獲得 1株具有高度立體選擇性的 Candida parapsilosis JNYX,其不對稱還原2-HAP能夠制備(R)-PED,e.e.值大于99.9%。水相反應(yīng)體系研究表明,該方法存在2個主要缺陷。首先,非天然底物2-HAP溶解度僅為11g/L,限制了反應(yīng)底物濃度的提高;其次,在水相反應(yīng)體系中,催化劑對底/產(chǎn)物存在代謝作用,導(dǎo)致反應(yīng)質(zhì)量平衡顯著降低。非水多相萃取反應(yīng)體系是解決上述問題的一種簡單、有效的方法[13-14],本研究考察水/有機(jī)溶劑、水/助溶劑、水/樹脂(NKA-Ⅱ)、水/離子液體反應(yīng)體系對產(chǎn)物濃度和反應(yīng)質(zhì)量平衡的影響,結(jié)果見表1。

        由表1可知:異丙醇助溶劑體系和水/樹脂(NKA-Ⅱ)雙相反應(yīng)體系中反應(yīng)產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率沒有明顯變化;水/鄰苯二甲酸二丁酯雙相反應(yīng)體系中,產(chǎn)物質(zhì)量濃度下降0.97g/L,質(zhì)量平衡收率提高29.1%;水/[BMIM]PF6雙相反應(yīng)體系產(chǎn)物質(zhì)量濃度下降2.49g/L,質(zhì)量平衡收率增加42.8%。由于有機(jī)溶劑具有對催化劑有毒、易燃、易揮發(fā)[15]等缺點,ILs作為一種綠色溶劑,比有機(jī)溶劑穩(wěn)定并具有良好生物相容性[16-17],因此選擇ILs([BMIM]PF6)作為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行下一步研究。

        表1 反應(yīng)體系對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Table 1 Effects of reaction systems on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        2.2 離子液體類型對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        ILs對生物催化劑的催化特性具有重要影響[3,18],在水/離子液體雙相反應(yīng)體系中,ILs離解形成具有極性區(qū)域和非極性區(qū)域的微小結(jié)構(gòu),可以通過改變酶分子電荷分布、影響底物和產(chǎn)物的溶劑化狀態(tài)、改變反應(yīng)介質(zhì)的特性而影響酶促反應(yīng)催化效率。

        考察不同ILs對細(xì)胞不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響,結(jié)果見表2。由表2可知,ILs的水溶性對催化反應(yīng)具有明顯影響。親水性離子液體介質(zhì)中均沒有檢測到產(chǎn)物;疏水性離子液體反應(yīng)體系中檢測到產(chǎn)物,且反應(yīng)質(zhì)量平衡收率大于85%。這可能是因為疏水性離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)的催化效果與離子液體黏度有關(guān),黏度隨陽離子組分咪唑基碳鏈長度增加而增大[15,19-20]。高黏度反應(yīng)體系降低酶和底物之間的傳質(zhì)速率,是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降的主要原因。傳質(zhì)速率的降低同樣降低了細(xì)胞對底/產(chǎn)物的代謝速率,而反應(yīng)質(zhì)量平衡收率隨離子液體黏度增加而增加。綜合考慮反應(yīng)產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率,選擇離子液體[BEIM]PF6作為2-HAP不對稱還原制備(R)-PED的反應(yīng)介質(zhì)。

        2.3 反應(yīng)條件對水/[BEIM]PF6雙相體系中催化效率的影響

        2.3.1 輔助底物對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        不對稱還原反應(yīng)需要等量輔酶(NADH或NADPH)作為氫供體,酵母細(xì)胞內(nèi)輔酶量較少,需要向體系內(nèi)添加輔助底物以維持反應(yīng)正常進(jìn)行??疾觳煌o助底物對細(xì)胞不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響,結(jié)果見圖1。

        表2 不同ILs對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Table 2 Effects of various ILs on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        圖1 輔助底物對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.1 Effects of co-substrates on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        由圖1可知:醇類輔底物不能提高反應(yīng)產(chǎn)率,糖類輔底物則可以有效提高產(chǎn)率,當(dāng)果糖、蔗糖和葡萄糖作為輔助底物時,反應(yīng)產(chǎn)率較高。實際生產(chǎn)應(yīng)用中,果糖成本過高,與果糖相比,蔗糖和葡萄糖作為輔助底物時的產(chǎn)率僅分別降低了3.5%和5.9%。因此,選擇相對廉價的葡萄糖作為不對稱還原制備(R)-PED的輔助底物。

        2.3.2 葡萄糖用量對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        葡萄糖作為輔助底物時,其用量對催化反應(yīng)的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知:葡萄糖用量對反應(yīng)產(chǎn)率具有顯著影響,用量小于0.08g時,產(chǎn)率隨葡萄糖用量增加而增加;葡萄糖用量大于0.08g時,產(chǎn)率隨葡萄糖用量增加大幅度下降,說明過多的葡萄糖不僅不能提高產(chǎn)率,反而會對細(xì)胞代謝活性產(chǎn)生抑制作用,因此葡萄糖用量應(yīng)選擇在0.08~0.12g。由此可見,合理控制輔底物用量,對于提高反應(yīng)產(chǎn)率具有重要影響,同時輔底物用量與催化劑用量、底物濃度密切相關(guān),是反應(yīng)條件中影響反應(yīng)效率的關(guān)鍵因素。

        2.3.3 底物質(zhì)量濃度對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        考察水/[BEIM]PF6雙相體系中底物質(zhì)量濃度對不對稱還原反應(yīng)效率的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可知:底物質(zhì)量濃度變化對質(zhì)量平衡收率無明顯影響,但隨著底物質(zhì)量濃度增加,產(chǎn)物質(zhì)量濃度不斷增加,而產(chǎn)率持續(xù)下降。因此,在高底物濃度條件下,要將底物完全轉(zhuǎn)化需要大幅度延長反應(yīng)時間,然而反應(yīng)時間的延長和產(chǎn)物的不斷積累使催化劑受到的產(chǎn)物毒害及抑制作用增強(qiáng),嚴(yán)重降低整個批次反應(yīng)的時空轉(zhuǎn)化率。因此,底物質(zhì)量濃度應(yīng)選在20g/L左右。

        圖2 葡萄糖用量對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.2 Effects of glucose concentration on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        圖3 底物質(zhì)量濃度對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        2.3.4 催化劑用量對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        考察催化劑(細(xì)胞)用量對不對稱還原反應(yīng)效率的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可知:不對稱還原反應(yīng)產(chǎn)率隨催化劑用量增加而增加,由于催化劑對底/產(chǎn)物具有代謝作用,反應(yīng)質(zhì)量平衡收率隨催化劑用量增加而下降。同時,催化劑用量過多也會增加反應(yīng)體系黏度,影響反應(yīng)的傳質(zhì)。綜合考慮產(chǎn)率和反應(yīng)質(zhì)量平衡收率,催化劑用量應(yīng)控制在0.8g以內(nèi)。

        2.3.5 離子液體對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        兩相反應(yīng)體系中,細(xì)胞只有在水相中可催化不對稱還原反應(yīng),兩相體積比不僅決定了底/產(chǎn)物在兩相中的分配比,同時兩相體積比會影響相界面面積大小,從而影響生物轉(zhuǎn)化的效率[13]。因此,考察離子液體比例對反應(yīng)產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率的影響,結(jié)果見圖5。由圖5可知:離子液體的比例對反應(yīng)產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率都具有顯著影響。產(chǎn)率在離子液體比例為20%(體積比)時達(dá)到最大,而質(zhì)量平衡收率隨離子液體比例的增大持續(xù)增加,這是由于隨著離子液體比例增大,整個反應(yīng)體系黏度增加,高黏度反應(yīng)體系阻礙酶和底物之間的傳質(zhì)[21],降低了細(xì)胞對底/產(chǎn)物的代謝速率。綜合考慮反應(yīng)產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率,離子液體比例選擇為20%。

        圖4 細(xì)胞量對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.4 Effects of cell mass on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        圖5 離子液體用量對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.5 Effects of ILs volume ratio on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        2.3.6 緩沖液pH對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        反應(yīng)體系的pH不僅會影響羰基還原酶的活性,還會影響到細(xì)胞內(nèi)輔酶再生??疾旆磻?yīng)體系pH對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知:pH變化對反應(yīng)質(zhì)量平衡收率無明顯影響,對產(chǎn)率則存在影響,當(dāng)pH為2.0~4.0時,反應(yīng)產(chǎn)率維持在較高水平,隨著pH的進(jìn)一步升高,產(chǎn)率明顯下降,當(dāng)pH范圍在6.0~9.0時,產(chǎn)率保持在較低水平無明顯變化。因此,該反應(yīng)適宜控制在酸性環(huán)境下進(jìn)行,pH選擇在4.0。

        圖6 pH對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.6 Effects of pH value on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        2.3.7 反應(yīng)溫度對不對稱還原反應(yīng)效率的影響

        對于水/[BEIM]PF6雙相反應(yīng)體系,反應(yīng)溫度不僅影響細(xì)胞和羰基還原酶的活性,同時通過影響ILs黏度改變整個反應(yīng)的傳質(zhì)速率。圖7所示為反應(yīng)溫度(20~40℃)對反應(yīng)效率的影響。由圖7可知:產(chǎn)率在反應(yīng)溫度為25℃時達(dá)到最大。反應(yīng)質(zhì)量平衡收率在反應(yīng)溫度為40℃明顯降低,這是由于較高溫度下離子液體黏度降低有利于體系內(nèi)傳質(zhì),增大了細(xì)胞對底/產(chǎn)物的代謝速率。因此,反應(yīng)溫度在25℃時有利于反應(yīng)效率的提高。

        圖7 反應(yīng)溫度對不對稱還原2-HAP反應(yīng)效率的影響Fig.7 Effects of temperature on asymmetric reduction efficiency of 2-HAP

        2.4 水/[BEIM]PF6雙相體系中不對稱還原反應(yīng)條件的優(yōu)化

        在單因素實驗基礎(chǔ)上,設(shè)計L18(37)正交試驗優(yōu)化不對稱還原反應(yīng)的反應(yīng)條件。單因素實驗結(jié)果表明,輔助底物用量對不對稱還原反應(yīng)效率具有較大影響,同時輔底物用量與催化劑用量、底物濃度存在直接關(guān)系。因此在正交試驗設(shè)計中,催化劑用量采用m(催化劑)/m(輔底物)的方式表示,即以參與單位輔底物代謝所需細(xì)胞量表征催化劑用量;同樣,因輔底物用量直接決定整個輔酶循環(huán)過程中還原型輔酶的總量,還原型輔酶和底物轉(zhuǎn)化存在等摩爾量關(guān)系,因此底物質(zhì)量濃度以ρ(底物)/m(輔底物)表示。正交試驗設(shè)計各因素水平取值及結(jié)果見表3。

        表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

        對表3實驗結(jié)果進(jìn)行均值計算,分別得到當(dāng)產(chǎn)量、產(chǎn)率、質(zhì)量平衡收率最大時的反應(yīng)優(yōu)化條件,對三組優(yōu)化條件進(jìn)行驗證實驗(數(shù)據(jù)未列出)發(fā)現(xiàn),以產(chǎn)量為參考值時得到的優(yōu)化條件(0.1g葡萄糖,20g/L 2-HAP,0.7g菌體,[BEIM]PF625%,pH 3.0,反應(yīng)溫度25℃)下反應(yīng)效率最好,產(chǎn)物質(zhì)量濃度15.22g/L,產(chǎn)率76.1%,質(zhì)量平衡收率81.9%。

        進(jìn)一步對正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析,結(jié)果見表4。由表4可知:因素A、C、F的水平變化對于產(chǎn)量、產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率都具有較大影響。同時,為了將因素水平變化引起的實驗結(jié)果間的差異與誤差波動引起的差異區(qū)分開來,對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析,結(jié)果表明因素C對產(chǎn)量、產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率的影響具有顯著性,因素A、G對質(zhì)量平衡收率的影響具有顯著性。

        表4 正交試驗設(shè)計極差分析和方差分析Table 4 Range analysis and variance analysis of orthogonal experimental design

        由表4還可知:對3個主要影響因素A、C、F使用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化(數(shù)據(jù)未列出),最終確定不對稱還原2-HAP制備(R)-PED的反應(yīng)條件為0.08g葡萄糖,20g/L 2-HAP,0.55g菌體,反應(yīng)溫度25℃,pH 3.5,離子液體比例25%。該優(yōu)化條件下底物質(zhì)量濃度20g/L,反應(yīng)24 h后產(chǎn)物質(zhì)量濃度15.35g/L,產(chǎn)率76.8%,質(zhì)量平衡收率84.3%。本研究結(jié)果的底物濃度比已有文獻(xiàn)報道的最大底物質(zhì)量濃度12.5g/L[22]提高60%,產(chǎn)物濃度比已報道的最大產(chǎn)物質(zhì)量濃度7.39g/L[23]高107.8%。

        2.5 不對稱還原2-HAP反應(yīng)過程曲線

        在優(yōu)化反應(yīng)條件下跟蹤不對稱還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化過程,結(jié)果見圖8。由圖8可知:反應(yīng)過程中(R)-PED的光學(xué)純度始終大于99.9%。反應(yīng)前6 h,產(chǎn)物合成呈線性增加;反應(yīng)6 h后,由于底物濃度的降低和產(chǎn)物積累,反應(yīng)速度逐漸減慢;反應(yīng)至30 h時,水相底物濃度過低、產(chǎn)物進(jìn)一步積累導(dǎo)致產(chǎn)物合成速率十分緩慢,底物仍有1.86g/L剩余。此時,如果繼續(xù)延長反應(yīng)時間,產(chǎn)物合成量極小(數(shù)據(jù)未列出),同時質(zhì)量平衡收率隨反應(yīng)時間延長而下降,大大降低了反應(yīng)的時空轉(zhuǎn)化率,因此選擇在30 h終止反應(yīng)。反應(yīng)過程中催化劑對葡萄糖具有較高的代謝速率,反應(yīng)開始1 h葡萄糖即完全消耗。因此在反應(yīng)1 h后向反應(yīng)體系補(bǔ)加0.08g葡萄糖繼續(xù)反應(yīng)至24 h,催化反應(yīng)產(chǎn)率和質(zhì)量平衡收率分別為74.2%和80.4%,說明葡萄糖消耗殆盡并不是反應(yīng)后期反應(yīng)速率大幅下降的原因,維持補(bǔ)加葡萄糖反而會降低催化反應(yīng)效率。另外,整個反應(yīng)過程中,質(zhì)量平衡收率則一直保持緩慢下降,前6 h下降速度較快,這與細(xì)胞糖耗及不對稱還原反應(yīng)速率有關(guān)。

        圖8 不對稱還原2-HAP反應(yīng)過程曲線Fig.8 The time course of asymmetric reduction of 2-HAP

        2.6 水/[BEIM]PF6雙相體系中催化劑穩(wěn)定性的研究

        在生物催化劑的實際應(yīng)用中,催化劑穩(wěn)定性對催化劑的更換頻率、反應(yīng)時間和產(chǎn)率具有重要影響[24],因此考察近平滑假絲酵母在水/[BEIM]PF6雙相反應(yīng)體系中循環(huán)使用的穩(wěn)定性,結(jié)果見圖9。由圖9可知,與單水相體系相比,水/[BEIM]PF6雙相反應(yīng)體系中產(chǎn)物質(zhì)量濃度提高了84%,質(zhì)量平衡收率提高了96%。與單水相體系中細(xì)胞穩(wěn)定性比較,水/[BEIM]PF6雙相體系中近平滑假絲酵母保持了良好的穩(wěn)定性,說明離子液體對細(xì)胞具有很好的生物相容性。

        3 結(jié)論

        使用近平滑假絲酵母全細(xì)胞作為手性催化劑合成光學(xué)純(R)-PED,(R)-PED光學(xué)純度大于99.9%,簡化了后期分離提純步驟,提高了產(chǎn)品品質(zhì)。通過對離子液體進(jìn)行篩選,篩選到疏水性離子液體[BEIM]PF6構(gòu)建水/[BEIM]PF6雙相反應(yīng)體系。對該體系下各單因素對反應(yīng)的影響進(jìn)行研究,通過正交試驗設(shè)計和響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化水/[BEIM]PF6雙相體系的反應(yīng)條件。單純通過條件控制和反應(yīng)體系的改變,使反應(yīng)的產(chǎn)物濃度和質(zhì)量平衡收率比水相體系中分別提高了84%和96%,成功實現(xiàn)批次反應(yīng)產(chǎn)物濃度的大幅提高,同時催化劑在水/[BEIM]PF6雙相反應(yīng)體系中具有良好的操作穩(wěn)定性。

        圖9 水/[BEIM]PF6雙相體系和單一水相中催化劑的操作穩(wěn)定性Fig.9 Operational stability of catalyst in aqueous/[BEIM]PF6two-phase system and aqueous

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        (責(zé)任編輯 荀志金)

        Biological asymmetric reduction for preparation of chiral alcohols inhydrophobicity ionic liquids

        SONG Jie,MU Xiaoqing,WANG Dong,XU Yan
        (Key Laboratory Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

        Whole cells of Candida parapsilosis catalyze asymmetric reduction of 2-hydroxyacetophenone for preparation of optically pure(R)-1-phenyl-1,2-ethanediol.The multiphase extraction of bioconversion was applied to improve substrate concentration,yield and the mass balance of the asymmetric reduction reaction.Different non-aqueous reaction systems were compared and aqueous/hydrophobicity ionic liquids(ILs)1-butyl-3-ethylimidazolium hexafluorophosphate([BEIM]PF6)biphasic system shown better biocompatibility and high mass balance.The effects of the different co-substrates,co-substrate mass,substrate concentration,catalyst mass,ILs ratio,pH value and reaction temperature on the biological catalysis reaction were studied.Reaction conditions of asymmetric reduction of 2-hydroxyacetophenone was optimized by orthogonal experimental design and response surface experimental design.Under the optimized reaction conditions,product concentration,yield and mass balance reached 15.35g/L,76.8%,84.3%,respectively.The enantiomeric excess(e.e.)value of product was above 99.9%.

        asymmetric reduction;whole cells;(R)-1-phenyl-1,2-ethanediol;ionic liquids;mass balance

        O643.3;TQ244.2

        A

        1672-3678(2015)02-0001-08

        10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.001

        2014-03-13

        國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2011AA02A209);國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2011CB710802);國家自然科學(xué)基金(21176103);江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程

        宋 潔(1988—),女,河北邯鄲人,碩士研究生,研究方向:手性生物催化;王 棟(聯(lián)系人),副教授,E-mail:dwang@jiangnan.edu.cn

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