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天然二倍體和四倍體泥鰍鰭細胞系染色體組構成研究

李雅娟1，隋燚1，趙睿2，李霞1，周賀1，劉博1，馬海艷1

（1.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復及生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；2.北京市水產(chǎn)技術推廣站，北京101105）

摘要：對傳代20次的天然二倍體和天然四倍體泥鰍鰭細胞系進行染色體標本制備，并對其染色體核型、Ag-NORs及CMA3/DA/DAPI三重熒光染色等進行研究。結果顯示，①二倍體泥鰍鰭組織培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)目為2n=50，核型公式為：2n=10m+4sm+36t，NF=64；四倍體泥鰍鰭組織培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)目為4n=100，核型公式為：4n=20m+8sm+72t，NF=128。②天然二倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞中期染色體分裂相有2個Ag-NORs，天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞中期染色體分裂相有4個Ag-NORs，均位于第1對中部著絲粒染色體（M1）的末端。③天然二倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞染色體中期分裂相中CMA3陽性位點為2個，天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞染色體中期分裂相中CMA3陽性位點為4個；均位于核仁組織區(qū)，即第1對中部著絲粒染色體（M1）的末端。結果表明，天然二倍體和四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)細胞制備的染色體數(shù)目、核型和帶型與體細胞一致。

關鍵詞：泥鰍；二倍體；四倍體；細胞系；染色體組；Ag-NORs；CMA3/DA/DAPI

網(wǎng)絡出版時間2015-4-23 12:15:18

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150423.1215.011.html

李雅娟,隋燚,趙睿,等.天然二倍體和四倍體泥鰍鰭細胞系染色體組構成研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 46(4): 83-88.

Li Yajuan, Sui Yi, Zhao Rui, et al. Study on genosome constitution of natural diploid and tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus fin cells line[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(4): 83-88. (in Chinese with English abstract)

Study on genosome constitution of natural diploid and tetraploid loach

Misgurnus anguillicaudatus fin cells line

/LI Yajuan1, SUI Yi1, ZHAO Rui2, LI Xia1, ZHOU He1, LIU Bo1, MA Haiyan

1

(1. Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian Liaoning 116023, China; 2. Fisheries Technology Extension Station of Beijing, Beijing 101105, China)

Abstract:Fin cells of natural diploid and tetraploid loaches subcultured after 20 generations were used for chromosome preparation, and karyotype, Ag-NORs, and CMA3/DA/DAPI were studied primarily. Results showed as follows:①Chromosome number of diploid cells was 2n=50, karyotype was 2n=10m+4sm+ 36t, NF=64; and chromosome number of tetraploid was 4n=100, karyotype was 4n=20m+8sm+72t. NF= 128.②There were 2 Ag-NORs in the medium chromosome spread of diploid, and 4 in tetraploid, all in the terminal of the first metacentric chromosome(M1).③Positive CMA3sites in diploid were 2, and 4 in tetraploid, all in the neuclear organizer region, as the terminal of the first metacentric chromosome(M1). In conclusion, chromosome number, karyotype and band type of cultured cells of both diploid and tetraploid were consistent with somatic cells. Therefore, methods in this study could be of great value for researches of cytogenetic and molecular genetics of loaches.

Key words: Misgurnus anguillicaudatus; diploid; tetraploid; cell line; genome; Ag-NORs; CMA3/DA/DAPI

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）是我國常見的小型經(jīng)濟魚類，具有肉質細嫩，味道鮮美、營養(yǎng)豐富、易繁殖、抗性強等特點，是我國主要養(yǎng)殖魚類品種之一。

魚類細胞培養(yǎng)技術廣泛應用于環(huán)境毒理學、病毒學、腫瘤學、細胞生物學、資源保護以及遺傳學等領域。在魚類的遺傳學研究中，為魚類染色體的結構、基因定位及熒光原位雜交等研究奠定基礎[1]。楊坤等成功培養(yǎng)麥穗魚（Pseudorasbora parva）鰭條組織細胞，通過對傳代培養(yǎng)細胞的染色進行研究，證明麥穗魚有一對NORs，位于染色體末端[2]。王旭波等證明牙鲆（Paralichthys olivaceus）鰓細胞系（FG）經(jīng)多次傳代后，染色體發(fā)生變異，不適合牙鲆染色體核型、組型等方面研究[3]。宋立民等建立以鰭組織培養(yǎng)法為材料制作黃顙魚染色體標本方法[4]。近年來，本實驗室初步建立以鰭組織培養(yǎng)法為材料快速制備不同倍性泥鰍染色體標本的方法[5]。但關于不同倍性泥鰍培養(yǎng)的鰭細胞染色體結構的研究尚未見報道。因此，本研究對天然二倍體泥鰍，天然四倍體泥鰍的鰭細胞進行體外培養(yǎng)，對培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)目、核型、銀染（Ag-NORs）及CMA3/DA/DAPI三重熒光染色進行分析，確定不同倍性泥鰍鰭細胞經(jīng)細胞培養(yǎng)傳代后，染色體在結構上是否會發(fā)生變化，傳代細胞是否可用于泥鰍細胞遺傳學和分子遺傳學研究。該試方法可為泥鰍的細胞遺傳和分子遺傳學研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

天然二倍體（2n=50）泥鰍取自大連市水產(chǎn)品市場，體長10.30~11.00 cm，體重7.14~9.24 g。天然四倍體（4n=100）泥鰍取自湖北省武漢市，體長為14.90~15.60 cm，體重為15.48~21.89 g。實驗室水族箱暫養(yǎng)，暫養(yǎng)溫度為（25±1）℃。

1.2方法

1.2.1倍性鑒定

運用血紅細胞核體積測量和流式細胞儀等方法對收集的泥鰍進行倍性檢測，具體方法參考文獻[6]。

1.2.2鰭組織細胞培養(yǎng)及染色體標本的制備

天然二倍體和四倍體泥鰍鰭組織細胞原代、傳代培養(yǎng)及染色體標本制備參照劉博等[5]方法進行。

1.2.3銀染（Ag-NORs）

所用方法為Howell和Black[7]快速銀染法。將滴有染色體標本的載玻片置于65℃加熱器上預熱，將50%硝酸銀溶液與2%明膠溶液按照體積比2?1混勻后滴到載玻片上，蓋上蓋玻片；65℃條件下避光處理約2~3 min，當染成金黃色時取出，65℃水沖洗，自然風干、封片。在普通光學顯微鏡下鏡檢拍照。

1.2.4 CMA3/DA/DAPI三重熒光染色

主要參照Schweizer[8-9]方法，略有改動。將CMA3、DA、DAPI依次分別滴加在染色體標本上，其中CMA3作用60 min，其余15 min。MI緩沖液（pH=7.0）漂洗，1?1甘油和MI緩沖液（pH=7.0）混合后封片，水平置于4℃冰箱，3~7 d內(nèi)在熒光顯微鏡（Leica DM2000）下觀察拍照。

1.2.5染色體數(shù)目統(tǒng)計及核型分析

天然二倍體和四倍體泥鰍分別選擇分散狀態(tài)良好，染色體形態(tài)清晰的50個中期染色體分裂相進行統(tǒng)計計數(shù)，以確定染色體數(shù)目；核型分析參照Levan等[10]標準進行。

2　結果與分析

2.1鰭組織細胞的染色體數(shù)目及核型

用第20代不同倍性泥鰍鰭組織傳代培養(yǎng)細胞制備染色體，并進行染色體分析。結果顯示，二倍體泥鰍鰭組織培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)目為2n= 50（見表1，圖1a），核型公式為：2n=10m+4sm+ 36t，NF=64（見圖1b）；四倍體泥鰍鰭組織培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)目為4n=100（見表1，圖1c），核型公式為：4n=20m+8sm+72t，NF=128（見圖1d）。

2.2天然二倍體和四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)細胞的染色體Ag-NORs分析

天然二倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞的染色體的中期分裂中Ag-NORs的數(shù)目為2個（見圖2a），NORs所在的染色體在核型中的位置是第一對中部著絲粒染色體（M1）的端部區(qū)域（見圖2b）；天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞染色體的中期分裂相呈現(xiàn)出Ag-NORs的數(shù)目為4個（見圖2c），NORs所在的染色體在核型中的位置是第一組中部著絲粒染色體（M1）的端部區(qū)域(見圖2d）。

表1　二倍體和天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的染色體分裂相數(shù)目Table 1　Frequency and distribution of chromosome number of fin cells from diploid and atural tetraploid of loach

圖1　天然二倍體、四倍體泥鰍鰭組織細胞染色體中期分裂相及核型Fig. 1　Chromosomes karyotypes at metaphase of fin cells from diploid and nature tetraploid loaches

2.3 CMA3/DA/DAPI

二倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞染色體分裂相中顯示有2個明亮的CMA3熒光帶，且一強一弱（見圖3a）。位于第一對中部著絲粒染色體（M1）的短臂末端區(qū)域（見圖3b）；天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞染色體分裂相中顯示有4個明亮的CMA3熒光帶，且3強1弱（見圖3c），位于第一對中部著絲粒染色體（M1）的短臂末端區(qū)域（見圖3d）。

圖2　二倍體、四倍體泥鰍鰭組織細胞染色體Ag-NORs及核型（箭頭示銀染點）Fig. 2　Ag-NORs and Karyotypes in metaphase spreads of fin cells from diploid and nature tetraploid loaches

圖3　二倍體、四倍體泥鰍鰭組織細胞染色體CMA3/DA/DAPI分裂相及核型（箭頭示陽性部位）Fig. 3　CMA3/DA/DAPI signals and rDNA positioning of fin cells from diploid and nature tetraploid loaches

3　討論

3.1染色體數(shù)目及核型

染色體標本制備在細胞遺傳學研究中具有重要意義[11]。目前最常用的魚類染色體標本制備方法是通過活體注射PHA-秋水仙素制備染色體方法，該方法簡單易行，但材料是通過對活體的解剖獲得，導致活體死亡。不利于深入研究及材料魚保護。近年來，已有學者成功通過培養(yǎng)細胞制備出高質量可持續(xù)的染色體標本。安晶等研究表明將鯉魚新鮮血樣于4℃冷藏4 h、2 d、7 d后培養(yǎng)，均能得到較好的細胞染色體分裂相[12]。趙小平等研究表明影響外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體制備的因素很多[13]，在操作過程中及時發(fā)現(xiàn)問題并迅速采取補救措施，可提高外周血淋巴細胞染色體標本制備成功率。謝志威等采用改良的細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)成人外周血標本[14]，獲得高質量形態(tài)染色體標本，表明改良方法可保證染色體標本質量，且操作更方便快捷、重復性好，可推廣。耿波等以鯉魚淋巴細胞為材料制備出染色體標本[15]，研究表明肝素全血保存在4℃10 d內(nèi)，培養(yǎng)細胞均能制備出較好分裂相的染色體。樊廷俊等利用PEG介導的細胞融合方法將牙鲆鰓細胞與中國對蝦淋巴細胞融合獲得雜交細胞[16]，通過對雜交細胞的體外培養(yǎng)和病毒侵染試驗證明雜交細胞為對蝦病毒的靶細胞。曹麗萍等對半微量全血細胞培養(yǎng)制備羅非魚染色體標本的方法進行研究，證明此方法可獲得較好分裂相的染色體標本[17]。

許多魚類細胞系，在幾十次傳代中，遺傳特性不變，染色體在數(shù)目和形態(tài)上也不改變[18-19]。本研究結果顯示，二倍體泥鰍鰭培養(yǎng)20代的細胞染色體數(shù)目為2n=50、核型公式為：2n=10m+4sm+ 36 t，NF=64；四倍體泥鰍鰭組織細胞培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)目為4n=100，核型公式為：4n=20m+ 8sm+72t，NF=128。該研究結果與李雅娟等利用不同倍性泥鰍的活體鰓組織細胞制備的染色體數(shù)目及核型一致[6]?？梢哉J為細胞染色體在短期培養(yǎng)的過程中沒有發(fā)生變異。但也有一些細胞系在傳代過程中，染色體在數(shù)目和形態(tài)上會發(fā)生變異。如Kang等建立的牙鲆鰭細胞系FFN和脾細胞系FSP經(jīng)傳代60次左右[21]，模式染色體數(shù)分別變?yōu)?4和62，形態(tài)也幾乎全部成為中部著絲粒染色體。王旭波等研究表明，傳代第57代的牙鲆（Paralichthys olivaceus）鰓細胞系（FG）的染色體數(shù)目和組型開始發(fā)生變異，出現(xiàn)異倍體和部分非整倍體，但模式染色體的數(shù)目和染色體的組型仍然與牙鲆正常二倍體一致[22]。當細胞傳代至296次后，染色體數(shù)目和形態(tài)與牙鲆的活體鰓細胞及第57代的細胞相比，發(fā)生明顯變化。本研究僅研究傳代20代以內(nèi)，至于20代以后染色體數(shù)目和核型是否發(fā)生變化需深入研究。

3.2染色體帶型

NOR的數(shù)目是細胞遺傳學的穩(wěn)定指標。以攜帶Ag-NORs的染色體作為魚類染色體核型進化指標，對探討魚類系統(tǒng)分化有重要意義。通過對50多種北美鯉科魚類研究，Amemiya等發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)種類的北美鯉科魚類具有一對攜帶NORs的染色體，而且是鯉科魚類中較為原始的類型[23]。Takai 和Ojima對日本鯉科魚研究結果一致[24]。本文Ag-NORs分析結果顯示，天然二倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞中期染色體分裂相有2個Ag-NORs；天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞中期染色體分裂相有4個Ag-NORs，均位于第1對中部著絲粒染色體（M1）的短臂末端。采用CMA3/DA/DAPI三重熒光染色研究已普及到動植物及微生物等多種研究領域，NORs均能表現(xiàn)出CMA3陽性。因此，采用CMA3/DA/DAPI三重熒光染色技術可更快捷、更準確檢測NORs區(qū)域。在本試驗研究中，天然二倍體和天然四倍體泥鰍的CMA3陽性位點數(shù)目均與銀染相同，即NORs數(shù)量相同，且位置均在第1對中部著絲粒染色體（M1）末端，評明銀染結果的準確性與真實性。對天然二倍體泥鰍和天然四倍體泥鰍鰭培養(yǎng)的細胞染色體帶型研究發(fā)現(xiàn)，有部分同源染色體結構發(fā)生改變，同源染色體間，在形態(tài)上有較明顯差異。產(chǎn)生差異的原因主要有兩個方面：一是在制備染色體的過程中，經(jīng)過多次的震蕩、離心等，在這些機械外力的作用下可能導致染色體某一片段缺失；二是在制備染色體過程中，秋水仙素未吹打均勻，導致某一部分細胞受到秋水仙素的作用較強，使得這部分細胞的染色體形態(tài)皺縮變短。

本研究中Ag-NORs和CMA3/DA/DAPI三重熒光染色得到的NORs在染色體上的位點相同，均位于第1對中部著絲粒染色體（M1）短臂末端，即核仁組織區(qū)。結果與李雅娟等對不同倍性泥鰍體細胞染色體的研究結果[25-28]一致。因此可應用細胞培養(yǎng)制備高質量可持續(xù)的染色體標本技術替代體細胞制備染色體標本，以達到節(jié)約試驗成本、保護種質資源和獲得連續(xù)試驗結果目的；其次，通過對不同倍性泥鰍的鰭組織培養(yǎng)細胞染色體進行帶型分析，為泥鰍的細胞遺傳學研究和分子遺傳學研究奠定基礎，也為其他物種的遺傳學研究提供參考。

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作者簡介：李雅娟（1961-），女，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種。E-mail: liyajuan@dlou. edu. cn

基金項目：國家自然科學基金（31272650）；大連海洋大學博士啟動基金項目（017208）

收稿日期：2014-10-13

文章編號：1005-9369（2015）04-0083-06

文獻標志碼：A

中圖分類號：S917.4