康新莉，宋英，譚睿

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

黃芪降濁顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

康新莉1，宋英2，譚睿1

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

目的建立黃芪降濁顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜（TLC）法對(duì)黃芩、金櫻子、大黃進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中黃芩甲苷的含量。結(jié)果在選定的薄層色譜條件下，層析斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；含量測(cè)定時(shí)，黃芪甲苷質(zhì)量濃度在5.42～212.52 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好（r2=0.999 9，n=6），平均回收率為97.33%，RSD=1.85%（n=6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于控制該制劑的質(zhì)量。

黃芪降濁顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；黃芩甲苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

糖尿病腎病是糖尿病患者嚴(yán)重的并發(fā)癥［1-2］，其中瘀血與濁毒是其不愈或加重的癥結(jié)所在。黃芪降濁顆粒由黃芪、金櫻子、川芎等中藥組方，是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐總結(jié)出來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方，用于糖尿病腎病患者的對(duì)癥治療，有活血化瘀、托毒排膿降濁功效［3］。根據(jù)臨床需要和劑型的選擇，醫(yī)院將原湯劑改進(jìn)為顆粒劑，旨在提高患者的用藥依從性。筆者在劑型改進(jìn)的基礎(chǔ)上對(duì)黃芪降濁顆粒進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為其醫(yī)院制劑注冊(cè)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2424 ELSD型檢測(cè)器；Sartoius BS110型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ5200DE型超聲波清洗儀（上海昆山超聲波儀器廠(chǎng)）。黃芪降濁顆粒（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)為20120923，20120924，20120925）；陰性對(duì)照樣品（自制）；黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-200613）、金櫻子對(duì)照藥材（批號(hào)為110781-200613）、大黃對(duì)照藥材（批號(hào)為110781-200613），供含量測(cè)定用，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別［4］

黃芪：取本品8 g，加60℃水20 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液用水飽和的正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺黃芪的陰性對(duì)照樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法［2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10∶1∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1A。

金櫻子：取本品4 g，加乙醇30 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取金櫻子對(duì)照藥材及缺金櫻子的陰性對(duì)照樣品，同法制得對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法［2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠板G板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（5∶5∶1.5∶0.5∶2）的上層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1B。

金櫻子：取本品2 g，加甲醇40 mL，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，再加1 mL鹽酸，加熱回流30 min，冷卻，乙醚分2次振搖，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL溶解，作為供試品溶液。取缺金櫻子的陰性對(duì)照樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。取大黃酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法［2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（30∶10∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1C。

2.2 黃芪甲苷含量測(cè)定［5-11］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（36∶64）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；ELSD參數(shù)：漂移管60℃，氣體壓力30 Psi，噴霧器加熱60%模式、增益20；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按黃芪甲苷計(jì)算不低于4 000。

圖1 薄層色譜圖

2.2.2 溶液制備

稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品17.71 mg，精密穩(wěn)定，置25 mL容量瓶，加入甲醇充分溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.708 4 g/L的對(duì)照品貯備液，搖勻，待用。取顆粒5 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，加甲醇150 mL，超聲1 h，濾過(guò)，蒸干加40 mL水溶解，水飽和的正丁醇振搖4次，每次40 mL，合并正丁醇液，氨試液洗滌3次，每次40 mL，棄去氨液，用正丁醇飽和的水溶液洗滌3次，每次40 mL，取正丁醇液，蒸干，加甲醇溶解，置5 mL容量瓶中定容，作為供試品溶液。取缺黃芪的陰性對(duì)照樣品，研細(xì)，按供試品溶液制備方法制備，得陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，黃芪甲苷色譜峰分離良好，且樣品中其他成分對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定無(wú)干擾。

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密量取黃芪甲苷對(duì)照品貯備液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別定容于10 mL容量瓶中，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=10 984X-40 140，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在35.42～212.52 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一黃芪甲苷對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的RSD=1.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為20120923），精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD=1.86%（n=6），表明方法的重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD=1.14%（n=6），表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（批號(hào)為20120923），精密稱(chēng)定，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果批號(hào)為20120923，20120924，20120925的3批樣品中黃芪甲苷含量分別為0.1336，0.1374，0.1408 mg/g。根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果，暫訂本品每1 g含黃芪以黃芪甲苷計(jì)不得少于0.12 mg。

圖2 高效液相色譜圖

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 討論

根據(jù)該制劑處方組成，黃芪為主藥，其主要藥效成分為黃芪甲苷，故選擇黃芪甲苷作為含量測(cè)定指標(biāo)。曾試用色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Agilent C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），結(jié)果黃芪甲苷色譜峰分離度均良好，故選用后者。參考相關(guān)文獻(xiàn)并考慮到蒸發(fā)光檢測(cè)器的特點(diǎn)，溫度太低不利于檢測(cè)，采用柱溫分別為25，30，40℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果柱溫為30℃時(shí)分離相對(duì)較好，樣品穩(wěn)定，故選用柱溫為30℃。

參考2010年版《中國(guó)藥典（一部）》，在流速為1.0 mL/min條件下，試用乙腈-水（32∶68）、乙腈-水（36∶64）、乙腈-水（40∶60）為流動(dòng)相，結(jié)果乙腈-水（36∶64）為流動(dòng)相時(shí)黃芪甲苷色譜峰峰形和保留時(shí)間較好，故選用乙腈-水（36∶64）為流動(dòng)相。

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Quality Standard of Huangqijiangzhuo Granules

Kang Xinli1，Song Ying2，Tan Rui1
（1.College of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu，Sichuan China610031；2.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu，Sichuan China610075）

ObjectiveTo establish the quality standard for Huangqijiangzhuo Granules.MethodsTheRadix Astragali，Rosalaevigata Mickx，Rheum Palmatum were identified by TCL and the content of astragalosideⅣwas determined by HPLC.ResultsThe dapples in the TLC plate are clean and the result of Separation is good.and the negative control showed no interference.The mass concentration of astragalosideⅣhas a good linear relationship with the peak area in the range of 5.42-212.52 μg/mL（r2=0.999 9，n=6），the average recovery of astralosideⅣwas 97.33%，RSD=1.85%（n=6）.ConclusionThe method is simple，accurate and specific，and can be used to control the quality of the preparation.

Huangqijiangzhuo granules；TCL；HPLC；astragalosideⅣ；quality standard

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）20-0077-03

康新莉，女，在讀碩士研究生，藥師，研究方向?yàn)槊褡逅幬镔Y源評(píng)價(jià)，（電子信箱）1315356502@qq.com；譚睿，女，博士研究生，教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化和新制劑研發(fā)，本文通訊作者，（電話(huà)）028-8734667（電子信箱）tanrui@swjtu.edu.cn。

2015-04-13）