袁承軍，袁浩宇，俞瑜，王鵬

（1.四川省綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽621000；2.核工業(yè)四一六醫(yī)院藥劑科，四川成都610051）

高效液相色譜法測定益母草堿大鼠血漿濃度及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

袁承軍1，袁浩宇2，俞瑜2，王鵬2

（1.四川省綿陽市中心醫(yī)院，四川綿陽621000；2.核工業(yè)四一六醫(yī)院藥劑科，四川成都610051）

目的建立測定大鼠血漿中益母草堿質(zhì)量濃度的高效液相色譜（HPLC）法，并研究益母草堿在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。方法8只SD大鼠尾靜脈注射益母草堿后，采用HPLC法測定血漿中益母草堿的質(zhì)量濃度，流動(dòng)相為乙腈-0.02 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)pH=4.0）=60∶40，波長為277 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃。結(jié)果益母草堿在大鼠體內(nèi)分布符合二室模型，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)消除半衰期（t1/2α）為（0.46±0.13）h，t1/2β為（2.90±1.41）h，中心室分布容積（V）為（0.46±0.07）L/kg，藥時(shí)曲線下面積（AUC0-t）為（70.65±12.39）mg/（h·L）。結(jié)論該方法簡便、快速，可用于體內(nèi)益母草堿的測定及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

益母草堿；高效液相色譜法；藥代動(dòng)力學(xué)

益母草堿有多種生物活性，如改善心肌缺血、增加冠脈血流量、抗凝、抗血栓形成、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)血脂、縮宮止血、活血化瘀、抗糖尿病等作用［1-5］。筆者采用高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）法測定大鼠血漿中益母草堿的含量，并對益母草堿的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

日本島津LC-2010C型高效液相色譜儀；島津LC-Solution型色譜工作站；德國賽多利斯BS224S型萬分之一電子天平；Avati30型高速離心機(jī)（Beckman公司）；XW-80型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠）。鹽酸益母草堿（武漢東康源科技有限公司，批號為20120501）；鹽酸益母草堿對照品（成都貝斯特試劑有限公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。SD大鼠8只，體重180～200 g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號為SCXK（滬）2008-0016；試驗(yàn)前圈養(yǎng)3 d。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，3 μm）；檢測波長：277 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.02 moL/L磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)pH=4.0）=（60∶40，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃。

2.2 血樣處理

取血漿樣品0.1 mL，加入6%高氯酸溶液0.2 mL，旋渦沉淀蛋白1 min，10 000 r/min的速率離心5 min，取上清液進(jìn)樣50 μL，記錄色譜圖和峰面積，以外標(biāo)法按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中益母草堿的質(zhì)量濃度。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：大鼠空白血漿、大鼠空白血漿+益母草堿對照品、大鼠尾靜脈注射益母草堿后的血漿樣品色譜圖見圖1。益母草堿的保留時(shí)間約為7.5 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)與主峰的分離度符合要求，不干擾樣品的分離測定。

線性關(guān)系考察：取不同質(zhì)量濃度的益母草堿對照品溶液20μL，加入0.1 mL空白大鼠血漿中，使血漿中含益母草堿系列質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μg/mL，照2.2項(xiàng)下方法操作，記錄色譜圖。以益母草堿的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=3 526.1 C-1 093.3，r=0.999 4（n=7）。結(jié)果表明，益母草堿質(zhì)量濃度在0.5～40.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，最低定量限為0.5 μg/mL。

圖1 益母草堿的高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取0.1 mL空白大鼠血漿，配制高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，照2.2項(xiàng)下方法分別在同1日內(nèi)測定和連續(xù)測定3 d。結(jié)果質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，20.0 μg/mL時(shí)，日內(nèi)精密度RSD分別為4.97%，6.13%，5.52%（n=5），日間精密度RSD分別為7.85%，3.71%，4.69%（n=5），表明日內(nèi)和日間精密度均良好。

提取回收率試驗(yàn)：取空白血漿0.1 mL，分別配制成高、中、低質(zhì)量濃度（1.0，5.0，20.0 μg/mL）的益母草堿血漿樣品（Cr）各1份，按2.2項(xiàng)下方法記錄峰面積，并求出各質(zhì)量濃度下3次進(jìn)樣峰面積的平均值（Ar）。另取高、中、低已知質(zhì)量濃度（Cs）的益母草堿對照品溶液，不經(jīng)處理直接進(jìn)樣，得峰面積As。以前后2種處理測定得到的主峰峰面積之比（Ar/As）計(jì)算提取回收率，結(jié)果平均提取回收率為90.43%，RSD為6.71%（n=3）。

方法回收率試驗(yàn)：取0.1 mL空白大鼠血漿，配制高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，照2.2項(xiàng)下方法測定，帶入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，考察相對回收率。結(jié)果平均回收率分別為93.63%，90.10%，101.24%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取空白血漿0.1 mL，配制質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的質(zhì)控血漿樣品數(shù)份，分別于自動(dòng)進(jìn)樣器（5℃）中放置24 h，反復(fù)凍融3次，-80℃冰箱冷凍放置20 d，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度于自動(dòng)進(jìn)樣器中放置0，2，4，8，12，16，24 h時(shí)測定含量的RSD為7.92%，反復(fù)凍融3次，測得的RSD為3.15%，-80℃冰箱冷凍放置0，5，15，20 d時(shí)測得的RSD為4.73%，表明益母草堿血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

取SD大鼠8只，雌雄各半，體重180～200 g，服藥前禁食12 h，全程不禁水。次日晨尾靜脈注射益母草堿水溶液（5 g/L，加熱至37℃），給藥量為20 mg/kg。給藥4 h后統(tǒng)一進(jìn)食。并于給藥前及給藥0.08，0.17，0.66，1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，10.00 h時(shí)尾靜脈采血0.3 mL，以4 000 r/min的速率離心10 min，分離血漿，-80℃凍存待測。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

大鼠靜脈注射益母草堿后益母草堿的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。采用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)程序?qū)ρ帩舛群蜁r(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，益母草堿在大鼠體內(nèi)變化過程符合二室模型，結(jié)果見表1。

圖2 大鼠靜脈注射益母草堿后平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n=8）

表1 大鼠單劑量注射20 mg/kg益母草堿后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=8）

3 討論

益母草有效成分主要為益母草堿、水蘇堿、益母草定、益母草寧，目前已能通過合成獲得［6］，張金蓮等［7］研究了口服給藥后益母草堿及其代謝物在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和毒代動(dòng)力學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)益母草堿在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間為0.5～1.7 h，消除半衰期（t1/2）為2.1 h，具有吸收快和代謝快的特點(diǎn)，消除為線性動(dòng)力學(xué)，體內(nèi)主要以益母草堿葡萄糖醛酸結(jié)合物的形式存在。

本研究結(jié)果顯示，益母草堿在大鼠體內(nèi)分布符合二室模型，靜脈注射給藥后，在大鼠體內(nèi)的分布消除速度較快。

本研究中建立的測定血漿中益母草堿的HPLC法，樣品處理簡單，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)對測定無干擾，方法回收率為90.10%～101.24%，日內(nèi)、日間精密度RSD均小于10.00%，可用于益母草堿的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究。

［1］賀春暉，趙懿清，李霞，等.益母草堿藥理作用的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18（12）：1 419-1 423.

［2］錢海兵，徐玉平，羅魁.益母草堿對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠的降脂作用［J］.華西藥學(xué)雜志，2012，27（5）：528-530.

［3］李霞，陳飛虎，袁鳳來，等.益母草堿對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮的作用研究［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14（5）：481-486.

［4］Liu XH，Xin H，Hou AJ，et al.Protective effects of leonurine in neonatal rat hypoxic cardiomyocytes and rat infracted heart［J］.Clin Exp Pharmacol P，2009，36（7）：696-703.

［5］Loh KP，Qi J，Tan BK，et al.Leonurine protects middle cerebral artery occluded rats through antioxidant effect and regulation of mitochondrial function［J］.Stroke，2010，41（11）：2 661-2 668.

［6］Luo SS，Gu XF，Zhu YZ.Improved synthesis of leonurine as cardioprotective agent［J］.J Pharm Sci，2012，21（4）：292-295.

［7］張金蓮，劉洪瑞，毛煜，等.益母草堿及其代謝物在大鼠體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43（6）：451-454.

Determination of Concentration of Leonurine in Rat Plasma by HPLC and Its Pharmacokinetics

Yuan Chengjun1，Yuan Haoyu2，Yu Yu2，Wang Peng2
（1.Mianyang Municipal Central Hospital，Mianyang，Sichuan，China621000；2.Department of Pharmacy，416 Hospital of Nucleus Industry Ministry，Chengdu，Sichuan，China610051）

ObjectiveTo establish the HPLC method to detect the mass concentration of leonurine in rat plasma，and the pharmacokinetics was evaluated.MethodsThe mass concentration of leonurine in 8 rats was detected after intravenous injection of 20 mg/kg leonurine by HPLC.The mobile phase was acetonitrile-0.02 moL/L mono potassium phosphate（adjusting to pH=4.0 with phosphoric acid）=60∶40，at the flow rate of 1.0 mL/min and detected at 277 nm，the column temperature was 30℃.ResultsThe process of leonurine in rats fit two-compartment model.The main pharmacokinetic parameters were followed：t1/2αwas（0.46±0.13）h，t1/2βwas（2.90±1.41）h，V was（0.46±0.07）L/kg，AUC（0-t）was（70.65±12.39）mg/（h·L）.ConclusionThis method was accurate，stable and sensitive，which can be used for the determination and pharmacokinetic of Leonurine.

leonurine；HPLC；pharmacokinetics

R285.5；R284.1

A

1006-4931（2015）20-0034-02

袁承軍，男，副主任藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，（電子信箱）yuanchengjun0753@163.com；袁浩宇，男，副主任藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，本文通訊作者，（電子信箱）yhy416@ 126.com。

2014-11-13；

2015-02-12）