陳菲，方步武，吳咸中

（1.山東省聊城市人民醫(yī)院藥學部，山東聊城252000；2.天津醫(yī)科大學藥理學教研室，天津300070；3.天津市中西醫(yī)結合急腹癥研究所，天津300110）

3種中藥復方對藥物所致肝內膽汁淤積大鼠膽汁的影響*

陳菲1，2，方步武2，吳咸中3

（1.山東省聊城市人民醫(yī)院藥學部，山東聊城252000；2.天津醫(yī)科大學藥理學教研室，天津300070；3.天津市中西醫(yī)結合急腹癥研究所，天津300110）

目的觀察柴郁湯、芍甘湯和痛瀉要方在α-異硫氰酸萘酯（ANIT）造成的大鼠肝內膽汁淤積模型上的利膽作用。方法將健康Wistar大鼠96只分為12組，即正常對照組，膽汁淤積模型組（簡稱模型組），柴郁湯低、中、高劑量組，芍甘湯低、中、高劑量組，痛瀉要方低、中、高劑量組和熊去氧膽酸組，各8只。第1天對大鼠進行膽管插管；第2天早上正常對照組灌胃食用豆油，其余組灌胃4%ANIT；第4天早上各組均收集1 h膽汁，然后除正常對照組灌胃蒸餾水外，其余各組灌胃相應藥物，晚上再灌胃1次，灌胃1 h后收集1 h膽汁；第5天早晚各灌胃1次，晚上灌胃1 h后收集1 h膽汁。結果與給藥前比較，3種中藥復方給藥后第2天膽汁均明顯增多（P＜0.05）。結論柴郁湯、芍甘湯和痛瀉要方對藥物所致大鼠膽汁淤積皆有利膽作用。

α-異硫氰酸萘酯；柴郁湯；芍甘湯；痛瀉要方；膽汁淤積

膽汁淤積是由于各種原因導致膽汁生成、分泌減少或排泄障礙所產生的臨床綜合征，可分為肝內性和肝外性。柴郁湯、芍甘湯和痛瀉要方同屬于理氣開郁法的中藥小復方，廣泛應用于臨床，但這些方劑的作用各有側重。柴郁湯偏于疏肝活血，芍甘湯偏于柔肝解痙，而痛瀉要方偏于疏肝理脾。無論是肝內膽汁淤積還是肝內阻塞性膽汁淤積，疏肝利膽治療都是必需的。阻塞性膽汁淤積如膽道系統(tǒng)結石術后為防止結石復發(fā)，臨床需配合利膽治療；膽系感染在抗感染及去除梗阻的基礎上，也多配合利膽治療；即使是肝外梗阻，去除梗阻后配合利膽治療也有利于去除殘存的少量壞死脫落組織和防止感染。本研究中探討了這些復方對病理性膽汁淤積的利膽作用。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

健康Wistar大鼠96只，雌雄各半，體重230～250 g，軍事醫(yī)學科學院第四研究所提供，合格證號為準醫(yī)動006。柴郁湯（2 g/mL）、芍甘湯（2 g/mL）、痛瀉藥方（1 g/mL）均由天津市中西醫(yī)結合醫(yī)院南開醫(yī)院中藥劑型改革研究室提供；熊去氧膽酸片（常州制藥廠有限公司，批號為0412091）；α-異硫氰酸萘酯（ANIT，Sigma公司，批號為08420DD）。

1.2 方法

試驗用藥配制：3種中藥復方詳見表1。取ANIT粉末2 g，用食用豆油溶解，定容至50 mL，即配制成4%ANIT毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，用時振蕩搖勻。取30片熊去氧膽酸片（每片50 mg），用蒸餾水溶解定容至30 mL，振蕩，使熊去氧膽酸均勻懸浮于蒸餾水中，即配制成50 g/L的熊去氧膽酸混懸液，用時振蕩搖勻。

表1 3種中藥復方的用藥情況

動物分組及給藥：將96只健康Wistar大鼠分為12組，即正常對照組（A組），膽汁淤積模型組（簡稱模型組，B組），柴郁湯低、中、高劑量組（C1，C2，C3組），芍甘湯低、中、高劑量組（D1，D2，D3組），痛瀉要方低、中、高劑量組（E1，E2，E3組）和熊去氧膽酸組（F組），各8只。第1天對大鼠進行膽管插管；第2天早上A組灌胃食用豆油，其余組灌胃4%ANIT；第4天早上各組均收集1 h膽汁，然后除A組灌胃蒸餾水外，其余各組灌胃相應藥物，晚上再灌胃1次，灌胃1 h后收集1 h膽汁；第5天早晚各灌胃1次，晚上灌胃1 h后收集1 h膽汁。給藥容積為8 mL/kg。

大鼠肝內膽汁淤積模型制備：取大鼠，稱重，禁食24 h。腹腔注射10%水合氯醛（每100 g體重0.3 mL）麻醉大鼠，仰臥位固定在手術臺上，腹部備皮，75%乙醇消毒；剪開腹部正中的皮膚和肌肉，先找到胃，沿幽門部找到十二指腸，從肝門處找到開口于十二指腸乳頭部的膽胰管；用鑷子將覆蓋在上面的被膜剝離，分離出靠近十二指腸乳頭部的1.0～1.5 cm膽胰管；在剝離的膽胰管下穿過2根絲線，將靠近十二指腸乳頭部的絲線結扎牢固，另1根待扎；提起已結扎的絲線，用鑷子墊在已分離的膽胰管下面；用5 mL注射器的針頭在分離的膽胰管遠心端扎1個小口，把插管從小口處向肝門方向扎進0.5～1.0 cm，用待結扎的絲線結扎，可見淺黃色膽汁從膽胰管流出；在離胃幽門0.5～1.0 cm的十二指腸處用眼科剪作1個小切口，將插管插入約0.5 cm，并做荷包縫合；將2根插管的裸露端從皮下穿出，在背部正中偏下部用5 mL注射器的針尖連接起來，使膽汁在無需收集時能回流入十二指腸，模擬生理狀態(tài)時膽汁的分泌情況。需要收集膽汁時將大鼠放入固定器中，將背部針尖連接處拔出，將膽汁引流入Eppendorf管中。

觀察指標：觀察造模后大鼠活動有無異常、膽汁回流是否通暢，收集各組大鼠給藥前后共3個時間點的膽汁量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

試驗中，成功建立了肝內膽汁淤積模型并行清醒狀態(tài)下大鼠膽汁收集。膽管插管成功后，在大鼠背部插管中可見淺黃色膽汁充盈，拔開背部插管接口的一端可見膽汁流出，說明膽汁回流通暢。造模后的大鼠進食少，活動少，小便發(fā)黃。3種中藥復方對肝內膽汁淤積大鼠膽汁量的影響見表2。給藥后第2天與給藥前比較，各給藥組膽汁均增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

3.1 模型的建立

目前造成膽汁淤積的動物模型有膽管結扎膽汁淤積模型［1］、內毒素誘發(fā)的膽汁淤積模型［2］、藥物（如雌激素）誘發(fā)的膽汁淤積模型［3］，有的操作起來困難（如膽管結扎膽汁淤積模型，大鼠肝外膽管變異較多、極細、分支多少不一，有的可呈網狀，完全結扎較難），有的模擬病因較局限（如雌激素誘發(fā)的膽汁淤積模型，主要模擬了口服避孕藥引起的膽汁淤積以及妊娠肝內膽汁淤積的發(fā)生等）。本研究中采用了ANIT誘發(fā)的膽汁淤積模型。ANIT是一種間接肝毒劑，被廣泛用于肝內膽汁模型的復制。ANIT可損害肝內膽管上皮細胞，引起毛細膽管增生及小葉間膽管周圍產生炎癥，從而造成膽管阻塞，形成明顯的膽汁淤積；并伴隨以點狀壞死為主的肝實質細胞損害，出現(xiàn)膽汁分泌減少，血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）水平均顯著升高。其誘發(fā)大鼠肝損傷的生物化學和病理形態(tài)學改變與人類肝內膽汁淤積病變相似［4］。

3.2 膽汁的收集

以往觀察藥物的利膽作用都是收集麻醉狀態(tài)下大鼠的膽汁［5-6］，不足之處主要有：因麻醉時間不宜過長，故膽汁收集的時間點不可能太多，收集時間也不能太長；麻醉狀態(tài)下大鼠膽汁的分泌與生理狀態(tài)下的分泌可能存在差異，且由于膽汁不能回流入十二指腸，使測定結果可能會與真實結果存在偏差。

本研究中采用收集清醒狀態(tài)下大鼠膽汁的方法觀察藥物的利膽作用，收集的時間點較多（3個），收集時間長（2 d），可維持有效的膽汁肝腸循環(huán)，對膽酸池無影響，更接近生理狀態(tài)下大鼠膽汁的分泌。但收集清醒狀態(tài)下大鼠膽汁難度較大，一方面是膽管插管操作不易，插進膽胰管的插管過長易穿破膽胰管，過短易脫出膽胰管；另一方面是收集大鼠膽汁較難。本研究中共96只大鼠，有的大鼠在第2或第3個時間點時就將插管拔除。由于本研究中采用重復測量設計的方差分析統(tǒng)計數(shù)據，3個時間點的數(shù)據必須完整，故部分數(shù)據不能采用，導致最終只收集到74只大鼠的完整數(shù)據。

表2 3種中藥復方對肝內膽汁淤積大鼠膽汁量的影響（±s，mL）

表2 3種中藥復方對肝內膽汁淤積大鼠膽汁量的影響（±s，mL）

注：與A組比較，●P＜0.01；與B組同時間點比較，◆P＜0.05；與本組給藥前比較，■P＜0.05，△P＜0.01；與本組給藥后1 d比較，▲P＜0.01。

組別A組（n=6）B組（n=8）C1組（n=6）C2組（n=6）C3組（n=6）D1組（n=6）D2組（n=6）D3組（n=6）F1組（n=6）F2組（n=6）F3組（n=6）E組（n=6）給藥前1.027±0.080 0.650±0.226 0.420±0.122●0.588±0.180●0.416±0.076●0.582±0.156●0.535±0.069●0.495±0.106●0.427±0.132●0.422±0.085●0.428±0.101●0.286±0.140●給藥后1 d 1.175±0.137◆0.665±0.021 0.566±0.195 0.776±0.171 0.792±0.129◆0.657±0.107 0.712±0.106 0.710±0.089 0.585±0.199 0.650±0.114 0.560±0.170 0.432±0.140給藥后2 d 1.170±0.314◆0.605±0.050 1.176±0.367△▲◆1.874±0.448△▲◆2.056±0.732△▲◆0.785±0.098◆1.147±0.135△▲◆1.448±0.379△▲◆0.943±0.295■1.406±0.465△▲◆1.206±0.242△▲◆1.618±0.696△▲◆

3.3 3種中藥復方對膽汁量的影響

目前，對肝內膽汁淤積的治療主要包括抗生素、腎上腺皮質激素、熊去氧膽酸［7］、苯巴比妥、S-腺苷蛋甲硫氨酸、消膽胺、血漿置換、基因治療，但尚無特異性有效藥物。中醫(yī)藥在肝內膽汁淤積的治療方面有著悠久的歷史，且能發(fā)揮積極和明顯的作用。肝內膽汁淤積屬中醫(yī)“黃疸”范疇，主要病機是濕、熱、瘀、毒，造成膽汁淤積于內，無法通降下行。歷來對黃疸的中醫(yī)藥治療方法多不勝數(shù)，有從內容上辨證論治處方用藥或古方化裁變通方面等方法，形式上有單方、成方和驗方等。其治療法則主要有以下幾種：清熱利濕法，如《傷寒論》中的茵陳蒿湯；涼血解毒法，如《千金》中的犀角散；疏肝健脾法，如《景岳全書》中的柴胡疏肝散；活血化瘀法，有關研究證明了以赤芍、丹參為主藥的處方有利膽功效［8-9］。

芍甘湯源于東漢張仲景《傷寒論·太陽篇》，是常用的緩急止痛之方，由芍藥和甘草組方，治營陰不足、肝脾不和，癥見脘腹諸痛，四肢攣急等。痛瀉要方原名白術芍藥散，乃《景岳全書》引劉草窗的一首方劑，亦是臨床內科常用方劑，由白術、白芍、陳皮、防風組方，主治肝盛脾虛的泄瀉（以腹痛腸鳴、大便泄瀉、瀉后痛減為主要特征）。柴郁湯由柴胡和郁金組方，柴胡能疏肝氣，具有抗脂質過氧化作用，對保護肝細胞和恢復肝臟某些功能有一定作用［6］。郁金具有保肝作用，對大鼠中毒性肝炎有降酶、提高血漿總蛋白、促進白蛋白合成和抑制球蛋白生成作用，并具有抑制肝臟炎性反應和良好的抗損傷作用，能明顯促進肝細胞修復，保護肝細胞，促進肝組織再生；還具有利膽作用，能使膽囊收縮，促進膽汁分泌，并可使尿中尿膽素減少。大劑量郁金與其他中藥聯(lián)用可顯著降低血清膽紅素水平［10］。

本研究結果表明，除模型組外，各組給藥后膽汁量均較給藥前有所增加，尤以給藥后第2天明顯，說明柴郁湯、芍甘湯和痛瀉要方均有利膽作用?？紤]其作用機制可能與修復損傷肝細胞，穩(wěn)定肝細胞膜，從而使膜上的鑲嵌蛋白如Na+，K+-ATP酶活性恢復，為膽汁的排泌提供能量有關。

［1］Lee J，Azzaroli F，Wang L，et al.Adaptive regulation of bile salt transporters in kidney and liver in obstructive cholestasis in the rat［J］.Gastroenterology，2001，121（6）：1 473-1 484.

［2］高宇，柴進，李紹雪，等.川西獐牙菜醇提物對內毒素所致大鼠膽汁淤積性肝損傷的保護作用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2014，36（8）：769-773.

［3］Crocenzi FA，Mottino AD，Sanchez Pozzi EJ，et al.Impaired localisation and transport function of canalicular Bsep in taurolithocholate induced cholestasis in the rat［J］.Gut，2003，52（8）：1 170-1 177.

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［5］朱平生，龍愛華，王兵.不同經典方劑對肝內膽汁淤積大鼠肝腎功能的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（5）：200-201.

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Effects of 3 Chinese Formulas on Bile of Drug-Induced Cholestasic Rats

Chen Fei1，2，F(xiàn)ang Buwu2，Wu Xianzhong3

（1.Depantment of Pharmacy，Liaocheng People′s Hospital，Liaocheng，Shandong，China 252000；2.Department of Pharmacology，Tianjin Medical University，Tianjin，China300070；3.Tianjin Institute of Acute Abdomen in Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin，China300110）

ObjectiveTo observe the influence of Chaiyu Decoction，Shaogan Decoction and Tongxie prescription on ANIT-induced cholestasic rats.Methods96 healthy Wistar rats were divided into 12 groups，namely normal control group，model group，Chaiyu Decoction groups of low，middle and high dose，Shaogan Decoction groups of low，middle and high dose，and Ursodeoxycholic acid tablet group.On day 1，rats were treated with bile duct intubation.On day 2，rats of normal control group were administered bean oil，and other groups were treated with 4%ANIT.On day 4，each group was administered corresponding drug after being colleceted bile for 1 hour in the morning，and was treated accordingly again at night，then collected bile for 1 hour.On day 5，treatment was same as day 4 except rats were not collected bile in the morning.ResultsAfter treated with three Chinese traditional prescriptions bile of rats on day 2 was remarkably increased compared with group of non-treatment.Conclusion3 traditional Chinese prescriptions Chaiyu Decoction，Shaogan Decoction，Tongxie prescription have cholagogic actions on ANIT-induced cholestasic rats.

α-nephthylisothiocyanate；Chaiyu Decoction；Shaogan Decoction；Tongxie Prescription；cholestasis

R285.5；R289.5

A

1006-4931（2015）20-0014-03

陳菲，碩士研究生，主管藥師，研究方向為藥理學，（電子信箱）feier802003@163.com；吳咸中，中國工程院院士，研究方向為中西醫(yī)結合治療急腹癥，本文通訊作者，（電子信箱）wuxianzhong@yahoo.com.cn。

2015-02-05）

*天津市科技攻關計劃重大科技項目，項目編號：05YFGDSF02600。