唐喆　管靜

（南京市婦幼保健院藥劑科，江蘇南京210004）

RP-H PLC同時(shí)測(cè)定萬(wàn)古霉素和茶堿的血清藥物濃度

唐喆管靜

（南京市婦幼保健院藥劑科，江蘇南京210004）

目的：應(yīng)用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），建立同時(shí)測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素和茶堿濃度的分析方法，為臨床監(jiān)測(cè)萬(wàn)古霉素和茶堿血藥濃度提供實(shí)驗(yàn)手段。方法：采用外標(biāo)法，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，19∶81，pH=3.2），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，236，280 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)。結(jié)果：萬(wàn)古霉素在2.5～100.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 6），茶堿在2.5～50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 9）；萬(wàn)古霉素高、中、低濃度的提取回收率為87.28%～102.24%，方法回收率為100.89%～105.24%，日內(nèi)精密度為0.95%～3.48%，日間精密度為3.59%～4.20%；茶堿高、中、低濃度的提取回收率為99.55%～103.46%，方法回收率98.28%～99.76%，日內(nèi)精密度為0.95%～4.28%，日間精密度為1.58%～3.80%。結(jié)論：該方法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

反相高效液相色譜法；萬(wàn)古霉素；茶堿；血藥濃度監(jiān)測(cè)

萬(wàn)古霉素是一種糖肽類抗生素，臨床上主要用于對(duì)抗革蘭陽(yáng)性菌特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）所致的感染性疾病。萬(wàn)古霉素具有耳毒性、腎毒性等不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用時(shí)需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，以降低相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。茶堿是臨床常用平喘藥，治療指數(shù)窄，個(gè)體差異大，血藥濃度過(guò)高可引起呼吸、心跳停止等嚴(yán)重不良反應(yīng)。接受茶堿治療的患者均應(yīng)測(cè)定血藥濃度［3-4］。萬(wàn)古霉素與茶堿在臨床上時(shí)常聯(lián)合用藥，搶救危重患者［5］。目前尚未有同時(shí)監(jiān)測(cè)萬(wàn)古霉素與茶堿血藥濃度方法的報(bào)道。本文采用RP-HPLC法，意在建立同時(shí)監(jiān)測(cè)萬(wàn)古霉素與茶堿血藥濃度的方法，以滿足臨床需要。

1　儀器與試劑

1.1儀器

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵，SPD-15C紫外檢測(cè)器，DGU-A3在線脫氣機(jī)，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器），色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），電子天平（Mettler XS205），高速冷凍離心機(jī)（Thermo Sorvall ST 16R），pH計(jì)（Mettler DElTA320）。

1.2試藥

萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：130360-201302，純度90%），茶堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100121-201104，純度99.5%），購(gòu)于江蘇省食品藥品檢定研究院。甲醇和乙腈均為色譜純（美國(guó)天地TEDIA），磷酸二氫鉀和高氯酸均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）。

2　方法

2.1溶液的配制

精密稱取萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，精密稱取茶堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于20 mL容量瓶中，分別加入超純水稀釋至刻度，搖勻，分別得萬(wàn)古霉素與茶堿的儲(chǔ)備液，4℃避光保存。將萬(wàn)古霉素儲(chǔ)備液稀釋成濃度為12.5，25.0，50.0， 125.0，250.0，500.0 μg/mL的萬(wàn)古霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，將茶堿儲(chǔ)備液稀釋成濃度為12.5，25.0，50.0，100.0，125.0，250.0 μg/mL的茶堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，均4℃避光保存。

精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加超純水溶解至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.2，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，超聲脫氣后備用。

2.2色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，19∶81，pH=3.2），流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：236，280 nm（在波長(zhǎng)236 nm條件下檢測(cè)萬(wàn)古霉素，在波長(zhǎng)280 nm條件下檢測(cè)茶堿），柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.3樣品預(yù)處理

取血清樣品600 μL于2 mL EP管中，加入800 μL沉淀劑（甲醇-乙腈-6%高氯酸=1∶1∶6，V/V/V）沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，13 500 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.45 μm針頭過(guò)濾器濾過(guò)后，轉(zhuǎn)入樣品瓶中待測(cè)。

3　結(jié)果

3.1方法專屬性

在上述的色譜條件下，萬(wàn)古霉素與茶堿分離完全，血中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾（圖1），兩者的保留時(shí)間分別為10.703 min和14.021 min。

3.2線性范圍和檢測(cè)限

分別取“2.1”項(xiàng)下萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液與茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，加入空白血清600 μL，配制成含萬(wàn)古霉素2.5～100.0 μg/mL、茶堿2.5～50.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)濃度血清樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行預(yù)處理，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以樣品峰面積（Y）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸。萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y=9 606.8C-6 962.4，

圖1　萬(wàn)古霉素與茶堿的HPLC色譜圖

r=0.999 6（n=5）；

茶堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y=27 719C-988.52，

r=0.999 9（n=5）。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素在2.5～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，茶堿在2.5～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。萬(wàn)古霉素最低定量限為2.5 μg/mL，最低檢測(cè)限為1.0 μg/mL。茶堿最低定量限為1.0 μg/mL，最低檢測(cè)限為0.5 μg/mL。

3.3回收率與精密度

取人空白血清，分別加入萬(wàn)古霉素和茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成萬(wàn)古霉素濃度為2.5，25.0，100.0 μg/mL和茶堿濃度為2.5，20.0，50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度血樣各5份，按“2.3”項(xiàng)進(jìn)行前處理后測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5天。所測(cè)得藥物峰面積代入回歸方程計(jì)算測(cè)得量，以計(jì)算測(cè)得量與加入量之比即方法回收率；所測(cè)得藥物峰面積除以同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得峰面積，以計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表1。由表1可見，萬(wàn)古霉素和茶堿的回收率和精密度符合生物樣本的測(cè)定要求［6］。

3.4穩(wěn)定性考察

3.4.14℃條件下穩(wěn)定性考察分別取“2.1”項(xiàng)下萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液與茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，加入空白血清600 μL，配制成含萬(wàn)古霉素25.0 μg/mL、茶堿20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度血清樣本5份。于4℃冰箱內(nèi)分別放置0，1，3，5天和1周后按“2.3”項(xiàng)下操作，注入色譜儀，記錄峰面積。計(jì)算此條件下萬(wàn)古霉素與茶堿峰面積RSD值，分別為4.86%與5.25%。由此可知，血清樣品在4℃條件下保存一周內(nèi)可保持穩(wěn)定。

表1　血清中萬(wàn)古霉素與茶堿的回收率和精密度

3.4.2凍融穩(wěn)定性考察配制成含萬(wàn)古霉素25.0 μg/mL、茶堿20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度血清樣本5份。于-20℃冰箱內(nèi)分別凍存0，1，2，3周和1月，溶解樣品后按“2.3”項(xiàng)下操作，注入色譜儀，記錄峰面積。計(jì)算此條件下萬(wàn)古霉素與茶堿峰面積RSD值，分別為7.03%與6.86%。表明血清樣品在-20℃條件下凍存后可保持穩(wěn)定。

4　結(jié)論與討論

血藥濃度監(jiān)測(cè)試驗(yàn)中，一般常用的樣本預(yù)處理方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等［7-10］。有文獻(xiàn)報(bào)道，用高濃度硫酸鋅溶液沉淀血清中的蛋白，離心后進(jìn)樣［11］。但經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫酸鋅溶液沉淀蛋白后的上清液仍有渾濁，經(jīng)0.45 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾時(shí)，會(huì)堵塞過(guò)濾器，無(wú)法進(jìn)樣測(cè)定。也有文獻(xiàn)報(bào)道，以三氯醋酸溶液作為血清蛋白沉淀劑［12-13］。試驗(yàn)結(jié)果表明，以三氯醋酸溶液作血清樣本前處理時(shí)，血清中內(nèi)源性物質(zhì)與藥物色譜峰不能完全分離，干擾最終結(jié)果的測(cè)定。本研究以混合溶劑（甲醇-乙腈-6%高氯酸=1∶1∶6，V/V/V）作為蛋白沉淀劑，可以完全沉淀血清中蛋白，并保證樣品回收率。

文獻(xiàn)報(bào)道監(jiān)測(cè)萬(wàn)古霉素血藥濃度一般選用磷酸二氫鉀緩沖液和甲醇或乙腈作為流動(dòng)相［8，12］，監(jiān)測(cè)茶堿血藥濃度一般選用甲醇和水或緩沖鹽溶液作為流動(dòng)相［14-15］。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相比例對(duì)藥物色譜峰保留時(shí)間影響很大；緩沖液種類與pH值的選擇決定了藥物是否能順利地從色譜柱中洗脫。經(jīng)反復(fù)配比試驗(yàn)，最終選擇甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，19∶81，pH=3.2）作為流動(dòng)相。這一色譜條件可以很好分離萬(wàn)古霉素與茶堿，且血清內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)兩者的測(cè)定不產(chǎn)生干擾。

《中國(guó)藥典》2010年版第二部中，萬(wàn)古霉素和茶堿的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為280 nm和271 nm［16］。由于血清樣品中藥品濃度很低，萬(wàn)古霉素在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下吸收度偏低，該檢測(cè)波長(zhǎng)不能滿足試驗(yàn)需要（圖1D）。參考大量報(bào)道可知，萬(wàn)古霉素在波長(zhǎng)236 nm下有較好的紫外吸收［8，12］。茶堿在波長(zhǎng)236 nm下有一定紫外吸收，但空白血清樣品在波長(zhǎng)236 nm下與保留時(shí)間14 min處有一較小雜峰，該雜峰與茶堿的保留時(shí)間接近，干擾茶堿峰面積的計(jì)算（圖1A），故考慮采用雙波長(zhǎng)法排除干擾。參考《中國(guó)藥典》2010年版中茶堿的檢測(cè)波長(zhǎng)，在271 nm附近反復(fù)調(diào)整后發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)280 nm下茶堿保留時(shí)間附近無(wú)內(nèi)源性雜峰干擾，且茶堿峰強(qiáng)度較好。因此采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)法，在236 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)萬(wàn)古霉素，在280 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)茶堿，既保證了待測(cè)藥物的吸收度，又排除了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

綜上，本法能夠同時(shí)測(cè)定萬(wàn)古霉素與茶堿的血藥濃度，且血清取樣少，檢驗(yàn)快速穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，成本較低，適用于臨床監(jiān)測(cè)。

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Simultaneous Determination of Plasma Concentrations of Vancomycin and Theophylline by RP-HPLC

Tang Zhe，Guan Jing（Department of Pharmacy of Maternity and Child Health Care Hospital of Nanjing City，Jiangsu Nanjing 210004，China）

Objective:To establish an analytical method for the simultaneous determination of concentrations of vancomycin and theophylline in human serum by reversed phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）so as to provide an experimental means for clinical monitoring of plasma concentrations of vancomycin and theophylline.Methods:External standard method was applied and Agilent ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used.The mobile phase consisted of methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution（V/V，19∶81，pH=3.2），at a flow rate of 1.0 mL/min，the column was at 30℃and the dual detection wavelength was at 236 and 280 nm.Results:A good linearity ofthe concentration of vancomycin was obtained within a range of 2.5～100.0 μg/mL（r=0.999 6）and within a range of 2.5～50.0 μg/mL（r=0.999 9）for theophylline.The extraction recovery rates of vancomycin in high，medium and low concentrations were 87.28%～102.24%，the objective recovery rates were 100.89%～105.24%，the within-day relative standard deviation（RSD）of vancomycin was 0.95%～3.48%and the inter-day RSD was 3.59%～4.20%.The extraction recovery rates of theophylline in high，medium and low concentrations were 99.55%～103.46%，the objective recov-ery rates were 98.28%～99.76%，the within-day and inter-day RSD of theophylline was 0.95%～4.28% and 1.58%～3.80%respectively.Conclusion:The method is sensitive，selective，rapid，simple and accurate.It can be applied to testing clinical specimens and the study of pharmacokinetic.

RP-HPLC；Vancomycin；Theophylline；Monitoring of Blood Concentration

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.10.002

2015-06-10）

唐喆，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：tjj870520@hotmail.com