王 倩， 白函瑜， 毛學英

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用

王 倩， 白函瑜， 毛學英*

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

為探討酪蛋白糖巨肽（GMP）酶解物的二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制作用，選擇木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解GMP獲得糖巨肽酶解物，選擇甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺為底物的發(fā)色底物法檢測DPP-4活性。結(jié)果表明，GMP酶解物的DPP-4抑制效果優(yōu)于GMP本身，并且隨酶解時間的延長酶解物DPP-4抑制作用逐漸增加，其中GMP木瓜蛋白酶解物對DPP-4抑制效果最好，GMP木瓜蛋白酶酶解物作為DPP-4抑制劑具有潛在應用價值。

糖巨肽；酶解；DPP-4抑制劑

編者按：長期航天飛行對航天員身體的影響涉及多個方面，如腸胃功能減弱、心血管系統(tǒng)紊亂，甚至糖代謝失常等。研究表明，失重環(huán)境下人體對鉀、鋅的需求增加，而對鈉、鐵的需求降低，胰島素水平呈下降趨勢。飲食調(diào)節(jié)是保障航天員身體健康的有效途徑，本期的兩篇文章《酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用》和《電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定黑茶元素溶出特性》分別從食源性功能多肽和日常茶飲的角度為科學合理配置航天食譜提供了有益參考。

（主持人：陳斌研究員）

糖尿病是一種受遺傳和環(huán)境因素影響的多因素內(nèi)分泌疾病，主要表現(xiàn)為高血糖、糖尿和負氮平衡等代謝紊亂癥狀，還會引起足部壞疽、尿毒癥、腦血管病變、心肌梗死等并發(fā)癥，是危害人類健康的一種嚴重代謝性疾?。?-2］。糖尿病主要包括1型糖尿病、2型糖尿病兩種類型，其中2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）占全部糖尿病患者的90%以上［3-4］。目前對糖尿病的治療主要以西藥為主，但長期服用副作用大。

天然來源的二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑具有安全性良好、無不良反應、耐受性好等優(yōu)點［5］，DPP-4抑制劑逐漸成為干預2型糖尿病的新靶點。它通過競爭性的結(jié)合DPP-4的活性位點改變DPP-4構(gòu)象，降低DPP-4的催化活性，抑制DPP-4對腸促胰島素的降解，增加血液中腸促胰島素濃度，使腸促胰島素更好地發(fā)揮刺激胰島素釋放的作用，增強胰島細胞對血糖的敏感性，強化組織細胞對葡萄糖攝取利用，促進β細胞增生等作用［6］。

乳蛋白是乳中的主要營養(yǎng)成分，作為一種全價蛋白質(zhì)不僅能夠提供優(yōu)質(zhì)氨基酸，經(jīng)過適當可控酶解后還能釋放出生物活性肽，這些活性肽具有調(diào)節(jié)胃腸道運動、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗菌、清除自由基和促進礦物元素吸收等多種生物學功能［7-8］。乳蛋白肽還具有DPP-4抑制作用，有研究已經(jīng)從β-乳球蛋白酶解物中分離出了具有抑制DPP-4活性的肽Ile-Pro-Ala，Val-Ala-Gly-Thr-Trp-Tyr［9-10］。酪蛋白和乳清分離蛋白分別經(jīng)堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶酶解所得酶解物均具有DPP-4抑制作用［11-13］，但目前尚未見酪蛋白糖巨肽（GMP）及其酶解物DPP-4抑制作用的相關報道。

酪蛋白糖巨肽（glycomacropeptide，GMP）是κ-酪蛋白在胃蛋白酶作用下苯丙氨酸-蛋氨酸之間的肽鍵斷裂形成的含有64個氨基酸的糖基磷酸肽［14］。研究發(fā)現(xiàn)，GMP具有降低人體總膽固醇、甘油三酯、血糖、胰島素水平的能力［15］。在太空失重環(huán)境中，機體糖代謝會發(fā)生變化，如胰島細胞胰島素分泌量下降以及細胞糖消耗減少等［16-17］?；谌樵椿钚噪呢S富的生物學活性功能以及GMP血糖調(diào)節(jié)能力，本研究旨在探討GMP及其酶解物對DPP-4酶的抑制作用，為GMP的進一步開發(fā)利用提供基礎，也為GMP在太空失重環(huán)境中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶、DPP-4、Gly-Pro-PNA、Ile-Pro-Ile（又稱為Diprotin A）、TNBS，Sigma公司；堿性蛋白酶，丹麥諾維信公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，美國Amresco公司；酪蛋白糖巨肽，丹麥Arla公司；Tris粉末、NaOH（分析純）、HCl（分析純），北京化工廠。

1.2 儀器與設備

iMarkTMMicroplate Reader型酶標儀，美國Bio-RAD公司；L20型冷凍干燥機，北京松源華興有限公司；DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司；FE20型分析天平，北京塞多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GMP酶解物的制備［18］

利用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶分別酶解GMP，酶解條件如表1。按底物質(zhì)量濃度50 g/L稱取酪蛋白糖巨肽于室溫下充分溶解2 h，并將恒溫水浴鍋溫度調(diào)至各酶的最適溫度，加堿或酸調(diào)節(jié)達到酶最適pH值，再按酶與底物質(zhì)量分數(shù)為5%的比例把酶加入在恒溫水浴鍋中酶解。酶解過程中不斷加入1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl來維持酶最適pH值，分別于酶解0.25，0.50，0.75，1，2，3，4，5 h處取樣，最后在85℃滅酶15 min，凍干待用。

表1 4種蛋白酶酶解條件Tab.1 Hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.2 DPP-4活性測定［19］

檢測DPP-4活性采用發(fā)色底物法，底物選擇甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）。各物質(zhì)添加量如表2。按照樣品或Diprotin A、DPP-4、Tris-HCl緩沖液、Gly-Pro-PNA的順序依次加入96孔板，在37℃、pH值為8.0條件下反應30 min后于405 nm處用酶標儀測定吸光值。

DPP-4抑制率=［1-（OD實驗組-OD空白組）/（OD陰性對照組-OD空白組）］×100%。

表2 DPP-4活性測定體系各組分加入量Tab.2 Adding amount of reactants for DPP-4 inhibition assayμL

1.4 水解度測定

水解度（DH）測定采用三硝基苯磺酸（TNBS）法，樣品用1%十二烷基硫酸鈉稀釋后取0.125 mL先后與1 mL磷酸緩沖液、1 mL 0.1%TNBS溶液混勻在50℃條件下水浴避光反應60 min，用2 mL 0.1 mol/L HCl終止反應后室溫冷卻并于420 nm下測吸光值，見式（1）。式（1）中：h表示酶解物中每克被裂解的肽鍵的物質(zhì)的量，（meq/g protein）；htot表示每克原料蛋白質(zhì)的總肽鍵的物質(zhì)的量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±SD形式表示，采用SPSS13.0軟件中One-way ANOVA進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMP動物性蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度

GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物對DPP-4的抑制作用及其水解度變化如圖1。整體來看，隨著酶解時間的延長，GMP酶解物DPP-4抑制率和水解度均逐漸增加，水解度在第5小時達到最大值，GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物水解度最大值分別為4.09%±0.22%，4.71%±0.29%。GMP經(jīng)蛋白酶酶解0.25 h所得酶解物DPP-4抑制率與GMP無顯著性差異（P＞0.05）；GMP經(jīng)胰蛋白酶酶解5 h時，胰蛋白酶酶解物DPP-4抑制率達到最大值21.86% ±0.19%；GMP經(jīng)胃蛋白酶酶解3 h所得產(chǎn)物的DPP-4抑制率最高，為32.50%±0.38%（樣品終質(zhì)量濃度為1.0 g/L）。

圖1 GMP胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物DPP-4抑制率及其水解度Fig.1 DPP-4 inhibition rate and DH of GMP hydrolysates obtained by pepsin and trypsin

2.2 GMP其他來源蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度

GMP木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解物的DPP-4抑制率及其水解度如圖2。在蛋白酶作用下，GMP酶解物的DH隨酶解時間的增加逐漸增大，酶解時間為5 h時DH達到最大，木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解物DH最大值分別為11.33%±0.18%，9.31% ±0.37%。GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4抑制作用顯著優(yōu)于GMP本身（P＜0.05），酶解4 h所得酶解物的DPP-4抑制率最高為69.30%±1.58%，但與第1小時酶解物無顯著差異（P＞0.05）；GMP堿性蛋白酶DPP-4抑制率酶解時間的延長整體呈上升趨勢，第4小時酶解物的DPP-4抑制率最高為29.10%±0.97%，酶解時間為5 h時，酶解物的DPP-4抑制率下降，低于第4小時酶解物的DPP-4抑制率。

圖2 GMP木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶酶解物DPP-4抑制率及其水解度Fig.2 DPP-4 inhibition rate and DH of GMP hydrolysates obtained by papain andalkaline

2.3 GMP木瓜蛋白酶酶解物對DPP-4抑制作用

的劑量效應

由2.2結(jié)果可知，GMP經(jīng)木瓜蛋白酶酶解第1小時酶解物的DPP-4抑制效果最好，對該酶解物進行DPP-4抑制效果的劑量效應評價，結(jié)果如圖3。DPP-4抑制率隨酶解物濃度增加呈劑量依賴性增加，最大值為85.69%±0.17%，高于陽性對照Diprotin A（0.01 g/L）的DPP-4抑制率。GMP木瓜蛋白酶第1小時酶解物IC50為497.0 mg/L，Diprotin AIC50為19.71 mg/L。

圖3 不同濃度GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4抑制率Fig.3 DPP-4 inhibition rate of different concentrations of GMP hydrolysate obtained with papain

3 結(jié) 論

DPP-4抑制劑由于具有特殊的氨基酸組成、序列或者特殊的結(jié)構(gòu)從而可以與DPP-4酶活性位點結(jié)合［20-21］，進而可以抑制DPP-4對內(nèi)源性GIP和GLP-1的降解，延長和提高腸促胰島素的活性，促進胰島素分泌、降低血糖。多肽類物質(zhì)的N端第二位上有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）時，該多肽就會成為DPP-4發(fā)揮活性的主要底物，如乳源活性肽Val-Ala、Ile-Pro-Ala-Val-Phe、Ile-Pro-Ala-Val-Phe-Lys均具有DPP-4抑制作用［19，22］。

本研究發(fā)現(xiàn)，GMP酶解物的DPP-4抑制作用優(yōu)于GMP本身，主要由于蛋白酶的作用使含有64個氨基酸的GMP肽鍵斷裂產(chǎn)生了具有DPP-4抑制作用的肽段。其中，GMP木瓜蛋白酶酶解物DPP-4的抑制作用較好，這與木瓜蛋白酶特殊的作用位點有關。木瓜蛋白酶（3.4.22.2）可裂解堿性氨基酸（Arg、Lys、His），Leu或Gly的肽鍵，經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后能產(chǎn)生N端第二位上有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽。

GMP經(jīng)木瓜蛋白酶酶解1 h獲得的酶解產(chǎn)物對DPP-4抑制效果較好，作為一種乳源活性肽，其食用安全性高，作為DPP-4抑制劑用于糖尿病干預具有潛在應用價值。GMP酶解產(chǎn)物活性肽段的分離純化和氨基酸序列鑒定，及其抑制DPP-4活性的作用機制尚待進一步研究。

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Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitory Activity of Casein Glycomacropeptide Hydrolysates

WANG Qian， BAI Hanyu， MAO Xueying*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The aim of the present study was to investigate the dipeptidyl peptidase-4（DPP-4）inhibitory activity of glycomacropeptide（GMP）hydrolysates obtained with papain，alkaline，trypsin and protease. The DPP-4 activity was assayed by the chromogenic substrate with Gly-Pro-PNA as a substrate in vivo. GMP hydrolysates showed a higher DPP-4 inhibitory rate than native GMP.The DPP-4 inhibitory activity of GMP hydrolysates increased during the hydrolysisperiods.GMP hydrolysates obtained by papain possessed the greatest DPP-4 inhibitory activity.The papain-treated GMP may have the potential application as DPP-4 inhibitor.

glycomacropeptide；hydrolysis；dipeptidyl peptidase-4 inhibitor

葉紅波）

TS252.1；Q816

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.004

2095-6002（2015）02-0019-05

王倩，白函瑜，毛學英.酪蛋白糖巨肽酶解物的二肽基肽酶-4抑制作用［J］.食品科學技術學報，2015，33（2）：19-23.

WANG Qian，BAI Hanyu，MAO Xueying.Dipeptidyl peptidase-4 inhibitory activity of casein glycomacropeptide hydrolysates［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：19-23.

2015-02-17

國家自然科學基金資助項目（31371753）；國家級大學生科研創(chuàng)新項目（201410019040）。

王 倩，女，碩士研究生，研究方向為乳源活性肽；

*毛學英，女，教授，博士，主要從事功能乳品方面的研究。

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