王旭明，胡文海,2，閆小紅,2

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交替呼吸途徑對(duì)低溫弱光下黃瓜葉片光合作用的保護(hù)研究

王旭明1，*胡文海1,2，閆小紅1,2

(1. 井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 江西省生物多樣性與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，吉安 343009)

以津研4號(hào)黃瓜品種為實(shí)驗(yàn)材料，采用1 mM的水楊基氧肟酸（SHAM）抑制47%~48%交替呼吸途徑（AOX途徑）活性，研究了交替呼吸途徑對(duì)低溫弱光（100 μmol· m-2· s-1，8 ℃）下黃瓜葉片光合作用的保護(hù)作用。結(jié)果表明，低溫弱光處理雖然降低了凈光合速率，但未引起光化學(xué)反應(yīng)、熱耗散和光合電子傳遞的變化，也未改變?nèi)豕庀挛展饽茉赑SII光化學(xué)反應(yīng)Y(II)、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散Y (NPQ)和非調(diào)節(jié)性能量耗散部分Y(NO)之間的分配比例，這可能歸功于低溫弱光誘導(dǎo)交替呼吸途徑的上調(diào)。低溫弱光下抑制AOX活性雖然完全抑制了光化學(xué)反應(yīng)和光合電子傳遞，并限制了凈光合速率，但誘導(dǎo)了熱耗散能力的增強(qiáng)，從而未引起光抑制的發(fā)生。由此可見(jiàn)，低溫弱光下AOX途徑活性的上調(diào)可有效地保護(hù)黃瓜葉片的光合電子傳遞鏈，并優(yōu)化光合作用；而抑制AOX活性后，黃瓜葉片也可通過(guò)促進(jìn)熱耗散防御低溫弱光下光抑制的發(fā)生。

黃瓜；低溫弱光；交替呼吸途徑；光合作用；水楊基氧肟酸

作為植物綠色細(xì)胞中主要的能量與物質(zhì)代謝中心，葉綠體和線粒體之間具有密切的聯(lián)系[1-2]。葉綠體光化學(xué)反應(yīng)所形成的還原性物質(zhì)NADPH以蘋果酸的形式通過(guò)蘋果酸-草酰乙酸穿梭轉(zhuǎn)移到胞液中，并被其它細(xì)胞器如線粒體等所利用[3-5]。線粒體電子傳遞與氧化磷酸化過(guò)程被認(rèn)為在消耗葉綠體內(nèi)過(guò)量還原性物質(zhì)、優(yōu)化光合碳同化和防御光抑制等方面具有重要作用[2]。植物線粒體擁有細(xì)胞色素途徑和交替途徑兩條主要的電子傳遞鏈[6-7]，其中交替途徑通過(guò)交替氧化酶（AOX）將電子直接傳遞給分子氧，并不引起質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)移和ATP的形成，從而被認(rèn)為有利于葉綠體內(nèi)過(guò)量還原性物質(zhì)的消耗，并在防御植物光抑制中具有重要的作用[8-9]。研究表明，交替途徑的降低減少了葉綠體內(nèi)還原性物質(zhì)的輸出，增加了葉綠體內(nèi)NADPH/NADP+的比率[1]。干旱或強(qiáng)光脅迫下，抑制AOX活性也導(dǎo)致了植物葉片光合電子傳遞鏈的過(guò)度還原和光抑制程度的加劇[8,10]。

近年來(lái)逆境脅迫下植物葉片線粒體AOX途徑對(duì)葉綠體能量代謝的影響越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但相關(guān)研究多集中于逆境脅迫下AOX途徑的增強(qiáng)緩解過(guò)剩光能對(duì)葉片造成的光抑制方面[7-8,11]，而對(duì)于葉片吸收光能未過(guò)剩的逆境脅迫下AOX途徑與葉綠體內(nèi)能量代謝的關(guān)系卻鮮有研究。低溫是限制作物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子，冬春季節(jié)的低溫弱光是我國(guó)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)的最大障礙之一[12]。我們前期研究表明，低溫弱光雖然抑制了光合作用碳同化的進(jìn)行，但由于入射光強(qiáng)較弱，并未引進(jìn)葉片光合機(jī)構(gòu)的傷害[13]，并且低溫弱光誘導(dǎo)了黃瓜葉片線粒體交替呼吸的增強(qiáng)[14]。為此我們以黃瓜為材料，利用AOX抑制劑SHAM控制葉片內(nèi)AOX活性，通過(guò)研究低溫弱光脅迫下抑制葉片AOX活性后光合作用碳同化、光合電子傳遞和葉綠體內(nèi)能量分配的變化，以探明在低溫弱光脅迫下交替呼吸對(duì)葉綠體能量代謝與分配的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2014年6~8月在井岡山大學(xué)生物園進(jìn)行，供試黃瓜品種為津研四號(hào)（L. cv Jingyan No.4）。種子浸種催芽后播種于草碳土中，兩片子葉充分展開時(shí)移入15 cm × 15 cm的花盆中，培養(yǎng)基質(zhì)為菜園土，正常水肥管理。待黃瓜幼苗培養(yǎng)至三葉一心時(shí)，選擇生長(zhǎng)一致的植株進(jìn)行以下四種處理：處理1（常溫弱光，NT）：植株置于人工培養(yǎng)箱中25 ℃，100 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)；處理2（常溫弱光+SHAM，NT-SHAM）：植株葉片噴施0.1 mM SHAM后，置于25 ℃，100 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)；處理3（低溫弱光，LT）：植株置于人工培養(yǎng)箱中8 ℃，100 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)；處理4（低溫弱光+ SHAM，LT-SHAM）：植株葉片噴施0.1 mM SHAM后，置于人工培養(yǎng)箱中8 ℃，100 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)。于處理的第4 d分別測(cè)定各處理植株完全展開葉的交替呼吸途徑活性、凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。試驗(yàn)共5次重復(fù)。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 交替呼吸途徑活性的測(cè)定

為了評(píng)價(jià)交替呼吸途徑的最大活性，取完全展開葉中部0.1 g，剪成2 mm的組織切段，加入2 mL反應(yīng)介質(zhì)(20 mM、pH7.2的磷酸緩沖液），采用1 mM的KCN抑制細(xì)胞色素氧化酶（COX）活性，利用Clark型液相氧電極（Oxygenlab，Hansatech, England），在25 ℃下測(cè)量組織耗氧量。

1.2.2 凈光合速率的測(cè)

選擇植株完全展開葉，避開葉中脈，采用Licor-6400XT（LI-COR，Lincoln，USA），利用儀器控制葉室CO2濃度為380 μmol·mol-1，光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為55%，葉室溫度25℃，測(cè)定葉片凈光合速率。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

選擇測(cè)定凈光合速率的同一葉片及相同部位，采用Dual-PAM-100/F（Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany）進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。首先將植株葉片暗適應(yīng)30 min后，測(cè)定其最小熒光Fo、最大熒光Fm和PSII最大光化學(xué)效率Fv/Fm，然后開啟120 μmol·m-2·s-1的光化光照射5 min后測(cè)定光適應(yīng)下葉綠素?zé)晒?，記錄Y(II)、qP、NPQ和ETR等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。將葉片再次暗適應(yīng)30 min后，測(cè)定其最小熒光Fo、最大熒光Fm和PSII最大光化學(xué)效率Fv/Fm，然后依次開啟由7~1450 μmol·m-2·s-1的光化光，每個(gè)強(qiáng)度的光化光照射葉片10s后，依據(jù)Dual-PAM-100使用說(shuō)明進(jìn)行葉綠素?zé)晒饪焖俟馇€的測(cè)定，記錄Y(II)、Y(NO)、Y(NPQ)和ETR等葉綠素?zé)晒鈪?shù)的快速光曲線。光化光由儀器內(nèi)置的LED光源提供635 nm光線。利用Ye等[15]光合電子流對(duì)光響應(yīng)的機(jī)理模型，由模型建立者葉子飄博士提供的計(jì)算軟件（光合計(jì)算4.1.1版本），計(jì)算最大光合電子流max和飽和光強(qiáng)PARsat。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性采用最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)在< 0.05水平上進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，圖表中不同字母表示在5%水平上處理間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫弱光和SHAM對(duì)交替呼吸的影響

由圖1可知，常溫弱光下黃瓜葉片交替呼吸途徑活性(VKCN)為11.46 μmolO2·g-1FW·h-1，低溫弱光處理誘導(dǎo)了VKCN上升到17.85 μmolO2·g-1FW·h-1，增幅為55.7%。經(jīng)SHAM處理后，常溫和低溫下葉片VKCN為5.95 μmolO2·g-1FW·h-1和9.46 μmolO2·g-1FW·h-1，其AOX活性抑制率分別為48.1%和47.0%。

圖1 低溫弱光和SHAM對(duì)黃瓜葉片交替呼吸途徑活性的影響

2.2 低溫弱光和SHAM對(duì)凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

低溫弱光處理使得黃瓜葉片凈光合速率(n)由常溫弱光下的4.96 μmol·m-2·s-1下降為3.59 μmol·m-2·s-1，降幅為27.3%；抑制AOX活性并未引起常溫弱光下n的明顯下降，加劇了低溫弱光下n的下降，在本實(shí)驗(yàn)條件處理下已完全測(cè)不出（表1）。常溫弱光下抑制AOX活性和低溫弱光處理均未引起黃瓜葉片F(xiàn)v/Fm，以及120 μmol·m-2·s-1的弱光下Y(II)、qP、NPQ和ETR的變化；低溫弱光下抑制AOX活性雖然未引起Fv/Fm的下降，但導(dǎo)致了Y(II)、qP和ETR的下降，以及NPQ的增強(qiáng)（結(jié)果見(jiàn)表1）。

表1 低溫弱光和SHAM對(duì)黃瓜葉片凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 低溫弱光和SHAM對(duì)電子傳遞速率快速光響應(yīng)的影響

低溫弱光處理未引起弱光下葉片ETR的下降，只有在高于800 μmol·m-2·s-1光照下ETR才隨著光強(qiáng)的增加而低于常溫弱光下葉片；抑制AOX活性未引起常溫弱光下葉片ETR的變化，但低溫弱光下抑制AOX活性則加劇了ETR的下降（圖2）。低溫弱光處理和常溫弱光下抑制AOX活性均未降低葉片max，但低溫弱光下抑制AOX活性顯著降低了max；而低溫弱光處理、常溫弱光和低溫弱光下抑制AOX活性均降低了PARsat（圖3）。

圖2 低溫弱光和SHAM對(duì)黃瓜葉片光合電子傳遞速率快速光曲線的影響

2.4低溫弱光和SHAM對(duì)快速光曲線的影響

由圖4可知，常溫弱光下抑制AOX活性并未引起Y(II)的變化，也未對(duì)弱光下Y(NPQ)和Y(NO)產(chǎn)生影響，但當(dāng)光強(qiáng)超過(guò)400 μmol·m-2·s-1時(shí)Y(NPQ)則明顯降低，并導(dǎo)致Y(NO)的增加；與正常溫度下相比，低溫弱光未引起Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的明顯變化，而低溫弱光處理下抑制AOX活性顯著降低了Y(II)，并促進(jìn)了Y(NO)的增加，而Y(NPQ)則表現(xiàn)為弱光下得到增加強(qiáng)光下有所下降。

圖4 低溫弱光和SHAM對(duì)黃瓜葉片Y(II)、Y(NPQ) 和Y(NO)快速光曲線的影響

3 討論

光合作用包括光反應(yīng)和碳同化兩個(gè)階段，光反應(yīng)通過(guò)光合電子傳遞和磷酸化將葉片吸收光能轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH和ATP等還原力，碳同化則利用還原力進(jìn)行CO2的固定[2,16]。逆境脅迫下植物光合碳同化能力的下降導(dǎo)致了Calvin循環(huán)對(duì)NADPH和ATP需求的減少，從而引起葉綠體內(nèi)吸收光能利用能力的下降，并造成光抑制的發(fā)生[17-19]。植物既可通過(guò)熱耗散等葉綠體內(nèi)能量耗散途徑以減少還原力的形成[20]，也可通過(guò)交替呼吸等線粒體內(nèi)能量耗散途徑消耗葉綠體內(nèi)部分過(guò)剩的還原力，以減緩葉綠體內(nèi)還原力形成與利用的失衡，從而緩解光抑制[2]。本試驗(yàn)中，低溫弱光處理誘導(dǎo)了黃瓜葉片交替呼吸途徑活性上調(diào)了55.7%（圖1），降低了P，但未引起Fv/Fm，以及弱光下（120 μmol·m-2·s-1）Y(II)、qP、NPQ和ETR的變化。這表明100 μmol·m-2·s-1入射光強(qiáng)和8oC低溫弱光處理下，光合碳同化限制所積累的還原力可通過(guò)交替呼吸的上調(diào)所消耗，因而未對(duì)光合電子傳遞造成明顯影響。而利用SHAM抑制了47.1%交替呼吸途徑活性后的黃瓜葉片在低溫弱光下其光合作用完全被限制，Y(II)、qP和ETR也明顯下降，但誘導(dǎo)了NPQ的增強(qiáng)，并且未引起Fv/Fm的下降（表1）。由此可見(jiàn)，交替呼吸途徑的順利進(jìn)行有利于優(yōu)化低溫弱光下黃瓜葉片的光合作用和光合電子傳遞的進(jìn)行，然而抑制交替呼吸后黃瓜葉片也可通過(guò)促進(jìn)熱耗散能力消耗過(guò)剩光能以保護(hù)光合機(jī)構(gòu)。

利用調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)測(cè)量的快速光曲線由于測(cè)量時(shí)間短，測(cè)量過(guò)程對(duì)光合狀態(tài)的影響小，能夠很好地反映樣品的實(shí)時(shí)光合狀態(tài)[21-22]。通過(guò)比較葉綠素?zé)晒釫TR快速光曲線可知，低溫弱光處理并未引起低于800 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)下葉片ETR的下降，也未降低其max，只是降低了其PARsat；而抑制AOX活性則明顯抑制了低溫弱光下黃瓜葉片的ETR、max和PARsat（圖2、3）。由此可見(jiàn)，交替呼吸活性的上調(diào)有利于維持低溫弱光下黃瓜葉片光合電子傳遞的順利進(jìn)行，只有當(dāng)葉片吸收光能超過(guò)其可利用和消耗的范圍后過(guò)剩光能才會(huì)對(duì)光合電子傳遞起到抑制作用。

PSII反應(yīng)中心吸收光能主要有三個(gè)去處，即PSII光化學(xué)反應(yīng)所利用的能量部分Y(II)、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散(如熱耗散等)部分Y(NPQ)和非調(diào)節(jié)性的能量耗散部分Y(NO)，Y(II)+Y(NPQ)+ Y(NO) = 1[23]。進(jìn)一步分析葉片吸收光能分配的快速光曲線（圖4）可知，與正常溫度下黃瓜葉片相比，低溫弱光處理未引起Y(II)和Y(NPQ)的顯著差異，并且弱光下（低于800 μmol·m-2·s-1）Y(NO)也沒(méi)有差異，但當(dāng)光強(qiáng)高于800 μmol·m-2·s-1時(shí)低溫弱光導(dǎo)致了Y(NO)的增加；而抑制交替呼吸則明顯降低了弱光及強(qiáng)光下黃瓜葉片Y(II)，顯著地提高了Y(NO)，對(duì)Y(NPQ)則表現(xiàn)為弱光下增大強(qiáng)光下降低的現(xiàn)象。Y(NO)較高表明植物葉片的光化學(xué)反應(yīng)能力和具有保護(hù)作用的調(diào)節(jié)性能量耗散機(jī)制不足以將吸收光能安全地消耗掉，將會(huì)造成吸收光能的過(guò)剩并對(duì)光合機(jī)構(gòu)產(chǎn)生傷害[23]。由此可推測(cè)，低溫弱光所誘導(dǎo)的AOX活性上調(diào)有效地維持了弱光下葉片吸收光能的分配，但當(dāng)吸收光能過(guò)高時(shí)仍會(huì)有過(guò)剩光能的產(chǎn)生；而抑制AOX活性則會(huì)減少葉綠體內(nèi)還原物質(zhì)的消耗，從而不利于光化學(xué)反應(yīng)的順利進(jìn)行，在較弱光照條件下即會(huì)造成吸收光能的過(guò)剩。這也表明交替呼吸途徑的順利進(jìn)行有利于優(yōu)化低溫弱光下黃瓜葉片的光化學(xué)反應(yīng)和光合電子傳遞的進(jìn)行，而低溫弱光下抑制AOX活性可通過(guò)促進(jìn)熱耗散等保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制以減輕過(guò)剩光能的積累。

而正常溫度下抑制AOX活性并未引起黃瓜葉片n、Fv/Fm、qP、NPQ、max，以及ETR和Y(II)快速光曲線的變化，也未對(duì)弱光下Y(NPQ)和Y(NO)產(chǎn)生影響，只是促進(jìn)了較強(qiáng)光照下Y(NPQ)的降低和Y(NO)的增加。這結(jié)果說(shuō)明在常溫下當(dāng)葉片吸收光強(qiáng)較弱時(shí)，植物葉片光合電子傳遞所產(chǎn)生的同化力NADPH主要被碳同化所利用，因此抑制AOX途徑并未對(duì)葉綠體光化學(xué)反應(yīng)和光合電子傳遞產(chǎn)生影響，也不需要通過(guò)增強(qiáng)熱耗散等保護(hù)機(jī)制以減少還原力的形成。孟祥龍等[24]的研究也表明，弱光下抑制AOX活性所引起的蘋果酸-草酰乙酸穿梭系統(tǒng)的兩個(gè)關(guān)鍵酶NADP-MDH和NAD-MDH的活性，以及ΦPSII（即Y(II)）、ETR和光合放氧速率的變化均顯著低于強(qiáng)光處理。由此可見(jiàn)，交替呼吸的順利進(jìn)行對(duì)于光能過(guò)剩環(huán)境下植物光合作用的優(yōu)化和光合機(jī)構(gòu)的保護(hù)作用更具重要意義。

綜合上述分析，我們推測(cè)當(dāng)黃瓜葉片吸收光能較弱時(shí)，低溫弱光誘導(dǎo)增強(qiáng)的交替呼吸可有效地消耗因碳同化下降所積累的那部分葉綠體內(nèi)過(guò)剩還原力，從而維持了光合電子傳遞的順利進(jìn)行，此時(shí)無(wú)需通過(guò)增強(qiáng)熱耗散等保護(hù)性能量耗散途徑以消耗過(guò)量光能，這將有利于保持植物葉片較強(qiáng)的光能吸收與利用能力；而當(dāng)AOX活性受到抑制時(shí)，葉綠體可通過(guò)誘導(dǎo)熱耗散能力的增強(qiáng)以消耗過(guò)剩光能，此時(shí)雖然光合電子傳遞和光化學(xué)能力受到了抑制，但并未對(duì)光合電子傳遞鏈造成進(jìn)一步的傷害。

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PROTECTIVE ROLES OF ALTERNATIVE OXIDASE PATHWAY IN PHOTOSYNTHESIS OF CUCUMBER LEAVES UNDER LOW TEMPERATURE AND WEAK LIGHT

WANG Xu-ming1,*HU Wen-hai1,2, YAN Xiao-hong1,2

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

In order to study the protective roles of alternative oxidase pathway in photosynthesis of cucumber leaves under low temperature (LT, 8 ℃) and weak light (100 μmol·m-2·s-1), a cucumber cultivar “Jinyan No. 4” was selected as experimental material, and the AOX inhibitor salicylhydroxamic acid (1 mM; SHAM) was used to inhibit AOX activityin both normal temperature (NT) and LT leaves. The results indicated that leaf AOX pathway was up-regulated after LT. Although net photosynthetic rate (n) decreased in leaves under LT, there were no change in photochemical reaction, thermal energy dissipation and photosynthetic electron transport were not changed. Also, LT was not influenced the energy distribution ratio between Y(II), Y(NPQ) and Y(NO). Inhibition of AOX pathway under LT decreased photochemical reaction and photosynthetic electron transport, and restrictedncompletely. However, photoinhbition did not occur because of the increase of thermal energy dissipation, which was induced by the down-regulation of AOX activity in leaves under LT. Taken together, up-regulation of AOX pathway would protect the photosynthetic electron transport chain and optimize photosynthesis in cucumber leaves under low temperature and weak light.

cucumber; low temperature and weak light; alternative oxidase pathway; photosynthesis; salicylhydroxamic acid

1674-8085(2015)06-0046-06

S642.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.06.010

2015-07-09；修改日期：2015-09-17

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20142BAB204014）；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ13545）

王旭明(1994-)，男，江西吉安人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)專業(yè)2012級(jí)本科生(E-mail：641029548@qq.com);

*胡文海(1973-)，男，江西吉安人，教授，博士，主要從事植物逆境生理方面的研究(E-mail：huwenhai@jgsu.edu.cn);

閆小紅(1977-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事植物生理生態(tài)方面的研究(E-mail：yanxiaohong325@126.com).