吳瓊 李阿梅 邵雪寶 臧潔 宋昊 溫斯健 姜祎群 孫建方

皮膚惡性黑素瘤腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與上皮間質(zhì)化指標(biāo)相關(guān)性的研究

吳瓊 李阿梅 邵雪寶 臧潔 宋昊 溫斯健 姜祎群 孫建方

目的 探討皮膚惡性黑素瘤標(biāo)本腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）浸潤情況與腫瘤臨床病理特征及上皮間質(zhì)化指標(biāo)之間的關(guān)系。方法 收集54例皮膚黑素瘤及15例良性色素痣石蠟標(biāo)本，用免疫組化法對TAM標(biāo)記CD163及上皮間質(zhì)化指標(biāo)上皮型鈣黏蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白在組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料±s表示，采用t檢驗、單因素方差分析、多因素線性回歸進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果 惡性黑素瘤標(biāo)本中檢測到CD163陽性的TAM，在色素痣標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)明顯的CD163陽性細(xì)胞。在原位黑素瘤中，TAM計數(shù)為16.97±8.74，在侵襲性黑素瘤中，TAM計數(shù)為35.08±13.78，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TAM計數(shù)為56.00±3.07，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TAM計數(shù)為28.70±18.52，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TAM計數(shù)在Clark分級中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且在Ⅰ～Ⅳ級TAM計數(shù)隨Clark級別增高而增加，Ⅳ級與Ⅴ級之間的TAM計數(shù)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。TAM計數(shù)在不同性別、不同年齡、肢端/非肢端、是否潰瘍之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05）。多因素線性回歸結(jié)果顯示，皮膚惡性黑素瘤組織中，TAM計數(shù)與Clark分級、潰瘍、腫瘤進(jìn)展、神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白5個因素相關(guān)。結(jié)論 皮膚惡性黑素瘤中TAM可能通過促進(jìn)上皮間質(zhì)化使腫瘤發(fā)展，從而增加腫瘤的惡性程度。

黑色素瘤；痣和黑素瘤；巨噬細(xì)胞；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；病理學(xué)

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤相關(guān)慢性炎癥中的關(guān)鍵細(xì)胞，雖然TAM本身不具備惡性，但其與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用卻促進(jìn)了腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的首要步驟。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是Greenburg和Hay［1］在1982年提出的，指上皮細(xì)胞在特定的生理病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，細(xì)胞失去彼此間的連接，喪失極性，細(xì)胞形態(tài)改變，遷移能力增強(qiáng)，從而獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，盡管黑素細(xì)胞并非傳統(tǒng)的上皮成分，但黑素瘤向真皮間質(zhì)侵襲過程中存在EMT現(xiàn)象［2-3］。為探討皮膚惡性黑素瘤標(biāo)本TAM浸潤情況與腫瘤臨床病理特征及EMT指標(biāo)之間的相互關(guān)系，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測黑素瘤石蠟切片中TAM指標(biāo)CD163與EMT指標(biāo)上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)分析。

1 材料與方法

1.1 組織來源：2011—2014年，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院經(jīng)臨床及組織病理學(xué)確診的54例皮膚黑素瘤及15例色素痣石蠟標(biāo)本。54例皮膚黑素瘤患者中，男23例，女31例；年齡24～83歲，平均57.98歲。病程0.5個月至20年。肢端者43例，非肢端者11例。54例中原位黑素瘤13例，侵襲性黑素瘤41例。Clark分級Ⅰ～Ⅱ級32例，Ⅲ～Ⅴ級22例。組織病理學(xué)檢查證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例。

1.2 主要試劑：即用型鼠抗人單克隆抗體CD163購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，濃縮型兔抗人單克隆抗體上皮型鈣黏蛋白、波形蛋白均購自美國Cell Signaling Technology公司，濃縮型兔抗人多克隆抗體上皮型鈣黏蛋白購自美國Abcam公司。即用型快速免疫M(jìn)axVisionTM檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化法：石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)10 min，室溫自然冷卻；滴加一抗（上皮型鈣黏蛋白、波形蛋白單克隆抗體工作濃度分別為l∶400、1∶100，神經(jīng)型鈣黏蛋白多克隆抗體工作濃度為l∶150），4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗，濕盒內(nèi)37℃孵育15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，磷酸鹽緩沖液稀釋常規(guī)甲苯胺藍(lán)染液20倍后復(fù)染

30 min，1∶500冰醋酸溶液分化，顯微鏡下觀察，切片內(nèi)黑素顆粒染成墨綠色后中止分化，以區(qū)別DAB的棕黃色顯色，脫水透明后封片，光鏡下觀察結(jié)果。磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照，廠家提供已知陽性片作為陽性對照，以表皮細(xì)胞作為上皮型鈣黏蛋白的陽性內(nèi)對照，以真皮成纖維細(xì)胞作為神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白的陽性內(nèi)對照。

1.4 結(jié)果判定：CD163、上皮型鈣黏蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜棕黃色顆粒沉積。CD163陽性細(xì)胞即TAM，低倍鏡（×100）觀察切片TAM密集區(qū)域，然后隨機(jī)選取5個高倍鏡視野（×400），計數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)量，取平均值［4］。波形蛋白、上皮型鈣黏蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白陽性率由陽性細(xì)胞數(shù)之和占細(xì)胞數(shù)的百分率來計算，在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個視野，計算陽性細(xì)胞所占的百分率及染色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞百分率：0為無細(xì)胞顯色，1為<25%細(xì)胞顯色，2為25%～50%細(xì)胞顯色，3為>50%細(xì)胞顯色。染色強(qiáng)度：0為不顯色或顯色不清，1為淺黃色，2為棕黃色，3為深褐色，二項乘積得最終積分。根據(jù)積分判定：0～1分為陰性（-）、2～3分為弱陽性（+）、4～6分為中度陽性（++）、>6分為強(qiáng)陽性（+++）。結(jié)果判定由2名皮膚病理醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行，每張組化切片均與HE染色切片進(jìn)行對照，以正確判斷細(xì)胞陽性表達(dá)范圍。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料的統(tǒng)計分析以表示，采用t檢驗、單因素方差分析及多因素線性回歸進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD163陽性細(xì)胞表達(dá)：免疫組化結(jié)果顯示，54例皮膚惡性黑素瘤標(biāo)本中均存在CD163陽性的TAM（圖1～3），在15例良性色素痣標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)明顯CD163陽性的細(xì)胞。

2.2 皮膚惡性黑素瘤組織中TAM計數(shù)與臨床病理相關(guān)性：對性別、年齡、部位、腫瘤進(jìn)展、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否潰瘍組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在原位黑素瘤中與侵襲性黑素瘤中，在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，TAM計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在不同性別、不同年齡（<50歲和≥ 50歲）、肢端/非肢端、是否潰瘍之間比較，TAM計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05）。采用單因素方差分析法，對Clark分級進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：ClarkⅠ級15例，TAM計數(shù)16.97±8.74；Ⅱ級17例，TAM計數(shù)23.46±4.62；Ⅲ級11例，TAM計數(shù)35.69±6.07；Ⅳ級7例，TAM計數(shù)53.71±3.18；Ⅴ級4例，TAM計數(shù)56.00±3.07。TAM計數(shù)與Clark分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.553，P＜0.05），且在Ⅰ～Ⅳ級TAM計數(shù)隨Clark級別增高而增加，Ⅳ級與Ⅴ級之間的TAM計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。采用多因素線性回歸分析對全部指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Clark分級、潰瘍、腫瘤進(jìn)展、神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白這些因素與TAM計數(shù)顯著相關(guān)（P＜0.05）。臨床特征與皮膚惡性黑素瘤組織中TAM計數(shù)的關(guān)系，見表1。

2.3 上皮型鈣黏蛋白在皮膚惡性黑素瘤腫瘤組織呈陰性表達(dá)（圖4），神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白在黑素瘤腫瘤組織中呈現(xiàn)不同程度的陽性表達(dá)（圖5，6）。單因素方差分析結(jié)果顯示，在神經(jīng)型鈣黏蛋白中度及強(qiáng)陽性表達(dá)的黑素瘤組織中TAM計數(shù)顯著高于在神經(jīng)型鈣黏蛋白陰性或弱陽性表達(dá)的黑素瘤組織中的計數(shù)（F=152.41，P＜0.05）。TAM在波形蛋白中度及強(qiáng)陽性表達(dá)的黑素瘤組織中的計數(shù)顯著高于在波形蛋白陰性或弱陽性表達(dá)的黑素瘤組織中的計數(shù)（F=84.86，P＜ 0.05）。見表2。

圖1～3 皮損組織病理 原位及侵襲性皮膚黑素瘤組織中均可見散在CD163陽性表達(dá)的細(xì)胞，胞質(zhì)、胞膜呈深棕黃色（圖1～2：免疫組化 ×100；圖3：×400）

圖4 上皮型鈣黏蛋白在表皮細(xì)胞胞膜呈深棕黃色，在黑素瘤組織中為陰性表達(dá)（免疫組化×100）

圖5 神經(jīng)型鈣黏蛋白在黑素瘤細(xì)胞胞膜呈棕黃色，與染成墨綠色的原有黑素顆粒區(qū)分明顯（免疫組化×100）

表1 臨床特征與皮膚惡性黑素瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）計數(shù)的關(guān)系

3 討論

巨噬細(xì)胞根據(jù)環(huán)境不同大致可極化為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（M1型）及替代活化型巨噬細(xì)胞（M2型）［5］。在腫瘤組織內(nèi)，TAM表現(xiàn)出M2型巨噬細(xì)胞的特性［6］。CD68標(biāo)記所有巨噬細(xì)胞，而CD163為M2型巨噬細(xì)胞的特征性標(biāo)志［7］，本研究采用CD163陽性細(xì)胞代表TAM。有研究表明，在卵巢癌組織中的TAM的數(shù)量與卵巢癌的預(yù)后密切相關(guān)［8］。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中TAM與腫瘤的組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)［9］。對膀胱癌和甲狀腺癌的研究表明，腫瘤間質(zhì)中TAM增多可引起預(yù)后不良，其促腫瘤生長作用在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和腎癌等多種腫瘤中已經(jīng)被證實(shí)［10］。本研究結(jié)果顯示，良性色素痣中未見明顯TAM，黑素瘤組織中存在TAM，TAM計數(shù)在惡性程度不同的腫瘤組織中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示TAM在促進(jìn)黑素瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中可能起作用。

黑素瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有EMT的參與。Alonso等［11］通過大樣本實(shí)體腫瘤標(biāo)本的基因和蛋白分析提出，EMT在惡性黑素瘤的轉(zhuǎn)移過程中起到?jīng)Q定性的作用，研究了34例垂直生長期的黑素瘤患者并隨訪3年以上，通過微陣列基因芯片技術(shù)比較發(fā)生轉(zhuǎn)移和不發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的分子表達(dá)有顯著差異和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。Kreizenbeck等［12］檢測201例原發(fā)黑素瘤和274例轉(zhuǎn)移性黑素瘤中鈣黏蛋白相關(guān)分子的表達(dá)以及與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)和上皮性腫瘤一樣，失去上皮型鈣黏蛋白表達(dá)和預(yù)后差相關(guān)。有人對比黑素細(xì)胞和不同黑素瘤細(xì)胞株中EMT相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞通過表達(dá)上皮型鈣黏蛋白與角質(zhì)形成細(xì)胞黏附，但不表達(dá)神經(jīng)型鈣黏蛋白，而絕大多數(shù)黑素瘤細(xì)胞都不表達(dá)上皮型鈣黏蛋白，卻表達(dá)神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白［13］。有研究將誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子slug轉(zhuǎn)染進(jìn)入黑素瘤細(xì)胞株，導(dǎo)致該細(xì)胞上皮型鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞間的黏附減弱，細(xì)胞的遷移能力增加；通過siRNA沉默黑素瘤細(xì)胞株中slug的表達(dá)，結(jié)果剛好相反［14］。本研究結(jié)果顯示，黑素瘤組織中未見腫瘤細(xì)胞表達(dá)上皮型鈣黏蛋白，與既往研究相符，提示黑素瘤腫瘤細(xì)胞失去上皮化標(biāo)志，細(xì)胞之間失去正常的黏附性，而黑素瘤組織中表達(dá)間質(zhì)化指標(biāo)神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白，證實(shí)了黑素瘤組織存在上皮間質(zhì)化現(xiàn)象；多因素線性回歸（逐步排出法）排除混雜因素后的結(jié)果顯示，黑素瘤中TAM計數(shù)與Clark分級、潰瘍、腫瘤進(jìn)展、神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白5個因素相關(guān)（P＜0.05），說明TAM計數(shù)與腫瘤惡性程度及腫瘤間質(zhì)化程度之間存在相關(guān)性。TAM計數(shù)在神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白中度及強(qiáng)陽性表達(dá)的黑素瘤組織顯著高于在神經(jīng)型鈣黏蛋白及波形蛋白陰性或弱陽性表達(dá)的黑素瘤組織，提示TAM浸潤可能參與腫瘤細(xì)胞間質(zhì)化。本研究初步提示，黑素瘤TAM可能通過促進(jìn)上皮間質(zhì)化使腫瘤發(fā)展，從而增加腫瘤的惡性程度，具體發(fā)生機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

表2 皮膚惡性黑素瘤組織中神經(jīng)型鈣黏蛋白、波形蛋白表達(dá)與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）計數(shù)的關(guān)系

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Correlation analysis between tumor-associated macrophages and epithelial-mesenchymal transition in cutaneous malignant melanoma

Wu Qiong,Li Amei,Shao Xuebao,Zang Jie,Song Hao,Wen Sijian,Jiang Yiqun*,Sun Jianfang.
*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

s:Jiang Yiqun,Email:yiqunjiang@qq.com;Sun Jianfang,Email:sunjf57@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship of tumor-associated macrophage （TAM）infiltration in lesions with clinicopathologic features of cutaneous malignant melanoma （CMM）and epithelialmesenchymal transition （EMT）-related indicators.MethodsFifty-four CMM and 15 benign melanocytic nevus paraffin-embedded tissue samples were collected.An immunohistochemical study was performed to determine the expression pattern and intensity of the TAM marker CD163 as well as EMT indicators epithelial cadherin （E-cadherin）,neurologic cadherin （N-cadherin） and vimentin in these tissue samples.Count data were expressed as mean±standard deviation.Statistical analysis was carried out usingttest,one-way analysis of variance （ANOVA） and multivariate linear regression analysis with the software SPSS 17.0.ResultsCD163-positive TAMs were detected in CMM samples,but not in benign melanocytic nevus samples.The mean TAM count per high power field in tissue samples was significantly different between invasive andin situCMM （35.08±13.78vs.16.97±8.74,P<0.05）,and between melanoma with lymph node metastasis and that without （56.00±3.07vs.28.70±18.52,P<0.05）,and among melanoma with different Clark levels（P<0.05）.Additionally,the mean TAM count increased with the increase in Clark level fromⅠtoⅣ,but was insignificantly different between Clark levelⅣ and Ⅴ （P>0.05）.No significant difference was observed in TAM count between patients of different gender or age groups,between acral and non-acral melanoma,or between ulcerated and non-ulcerated melanoma （allP≥ 0.05）.Multivariate linear regression analysis showed that TAM count in CMM was associated with five factors:Clark level,ulceration,tumor progression,N-cadherin and vimentin.ConclusionTAMs may accelerate tumor progression and increase tumor malignancy by pro-moting EMT in CMM.

Melanoma;Nevi and melanomas;Macrophages;Epithelial-mesenchymal transition;Pathology

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.05.002

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131063）；2012年高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項科研基金（20121106110040）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年基金（5201-01-6068）

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室［吳瓊（現(xiàn)在上海市皮膚病醫(yī)院，200433）、李阿梅、邵雪寶、臧潔、宋昊、溫斯健、姜祎群、孫建方］

姜祎群，Email:yiqunjiang@qq.com;孫建方，Email:sunjf57@163.com

2015-01-06）