白雨鑫，郭　斌，韓冠英，崔　鏨（.遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧錦州000；.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州000）

蘿藦果殼多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

白雨鑫1，郭斌2，*，韓冠英2，崔鏨2
（1.遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧錦州121000；2.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000）

在單因素實驗基礎上應用響應面法對蘿藦果殼多糖提取條件進行優(yōu)化并初步評價其體外抗氧化活性。優(yōu)化的蘿藦果殼多糖提取條件如下：料液比為1∶18（g/mL），提取溫度為86℃，提取時間為3 h，提取次數(shù)為3次，此條件下的平均得率為11.22%；抗氧化活性實驗結果表明蘿藦果殼多糖對O2-、DPPH·的最高清除率分別為80.61%、73.01%。優(yōu)化的蘿藦果殼多糖提取工藝合理、可行，蘿藦果殼多糖具有較強的抗氧化性。

蘿藦果殼，多糖，響應面法，抗氧化活性

蘿藦（Metaplexis japonica），蘿藦科蘿藦屬，是多年生蔓性草本，在中國東北、西南、華南等地分布廣泛?！侗静輩R言》中記載，“蘿藦，溫平培補，統(tǒng)治一切勞損力役之人，筋骨血脈久為勞力疲痹（憊）者，服此立安［1］”研究表明，其根、果殼、全草均可入藥，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其主要含有的強心苷、C21甾體、生物堿及多糖等成分均具有重要的生物活性［2-5］。目前對蘿藦的研究主要集中在全草和根部，而對其果殼部位的研究較少。馬寅達等采用水提醇沉的方法提取蘿藦全草多糖，但多糖提取率為3.97%［6］。崔鏨等從蘿藦果殼部位提取多糖，發(fā)現(xiàn)其多糖提取率相對較高為4.97%［7］，但未對多糖進行提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性等方面的研究。本文在前期研究基礎上采用傳統(tǒng)的水提醇沉方法提取蘿藦果殼多糖，并應用響應面法（Response surface methodology，RSM）對多糖提取工藝影響較大的四個因素即料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)進行優(yōu)化，擬獲得經(jīng)濟、科學的提取條件。采用DPPH法、鄰苯三酚法和Fenton反應考察蘿藦果殼多糖體外抗氧化活性，為進一步探討其藥理活性提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘿藦果殼遼寧省錦州市周邊地區(qū)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 購自美國sigma公司；鄰苯三酚、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4） 均購自天津永晟精細化工有限公司；維生素C（VC） 購自國藥集團，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2550型紫外分光光度計日本島津；真空干燥箱上海一恒公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵上海東璽公司；BP 211D型電子分析天平德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋上海騰方公司；旋轉蒸發(fā)儀上海廣英公司；LD4-2A（Ⅱ）離心機北京京力公司。

1.2實驗方法

1.2.1蘿藦果殼多糖的提取取一定量蘿藦果殼粉碎并過40目篩，粉末經(jīng)乙醚浸泡過夜，除去脂類、低聚糖、色素和小分子物質(zhì)，揮發(fā)乙醚并干燥（55℃）［8］。在一定溫度下用熱水浸提干燥后的粉末，浸提后用300目篩網(wǎng)過濾，濾渣重復浸提數(shù)次，合并濾液。濃縮，醇沉使乙醇終濃度達到70%，4℃過夜，所得沉淀真空干燥后得蘿藦果殼粗多糖。參照文獻［9］采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，繪制葡萄糖標準曲線為A=0.1624C+0.0039，相關系數(shù)r=0.9992，線性范圍在0～100 μg/mL，并計算蘿藦果殼粗多糖得率。

1.2.2單因素實驗采用1.2.1下法提取蘿藦果殼多糖，提取條件為：固定反應條件為提取溫度60℃、提取時間2 h、提取次數(shù)2次，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對多糖得率的影響；固定反應條件為料液比1∶15、提取時間2 h、提取次數(shù)2次，考察不同溫度（50、60、70、80、90℃）對多糖得率的影響；固定反應條件為料液比1∶15、提取溫度60℃、提取次數(shù)2次，考察不同提取時間（1、2、3、4、5 h）對多糖得率的影響；固定每次反應條件為料液比1∶15、提取溫度60℃、提取時間2 h，考察不同提取次數(shù)（1～5次）對多糖得率的影響。進行單因素實驗，考察各因素變量對蘿藦果殼多糖得率的影響。

1.2.3Box-Benhnken中心組合實驗設計在單因素實驗的基礎上，每個因素選取三個對多糖得率影響較大的水平，建立四因素三水平的Box-Benhnken中心組合實驗，以多糖得率為響應值，各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼，如表1。

表1　響應曲面設計實驗因素水平和編碼Table 1　Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.4抗氧化性實驗取一定量最佳工藝條件下制備的蘿藦果殼多糖，進行抗氧化活性實驗。

1.2.4.1DPPH·清除率的測定參照文獻［10］，用無水乙醇配制終濃度為20 μmol/L的DPPH·乙醇溶液，取1 mL該溶液與2 mL多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）暗處混合，室溫反應30 min并測定混合液的吸光度（517 nm），樣品溶液吸光度值記為A1，無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液作為樣品本底組，吸光度值記為A2，蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，吸光度值記為A0，VC作為陽性對照，清除率計算公式：

1.2.4.2超氧陰離子（O2-）清除率的測定參照文獻［11］，在10 mL比色管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，pH8.2）、1 mL不同濃度多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）及2.4 mL蒸餾水混勻，10 min后加入0.1 mL的鄰苯三酚（6 mmol/L）溶液，混勻，計時3 min后立即加入0.1 mL的HCl（10 mmol/L）終止反應，并測定混合溶液的吸光度（325 nm），樣品溶液吸光度值記為A1，蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，吸光度值記為A0，VC作為陽性對照，清除率計算公式：

1.2.4.3羥自由基清除率的測定參照文獻［12］，在10 mL比色管中加入FeSO（46 mmol/L）、H2O（20.6 mmol/L）以及不同濃度的多糖溶液（0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）各2mL搖勻靜止10 min，之后加入2 mL水楊酸（6 mmol/L），搖勻靜止30 min，并測定混合液的吸光度（510 nm），樣品溶液吸光度值計為A1，蒸餾水代替H2O2作為樣品本底組，吸光度值計為A2，以蒸餾水代替樣品做空白組計為A0，VC作為陽性對照組，清除率計算公式如1.2.4.1。

圖1　料液比對多糖得率的影響Fig.1　Effect of ratios of water to material on extraction yield of polysaccharides

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1料液比對多糖得率的影響由圖1可知，多糖得率隨料液比的增加呈先增大后降低的趨勢，料液比在1∶20時，多糖得率達到最大值，之后隨料液比的增大而平緩下降。這是由于在一定范圍內(nèi)增加浸提液體積可以增大溶劑與浸提物的接觸面積，使水溶性的多糖能夠較多的溶出，但浸提液體積繼續(xù)增大會使多糖的溶出達到飽和，得率趨于平穩(wěn)或稍有降低［13］?？紤]到浸提液體積過大會增加提取時間、消耗能量，浸提液體積過小又會使多糖提取不完全而浪費原料，所以，選擇料液比在1∶15～1∶25之間最為合適。

圖2　提取溫度對多糖得率的影響Fig.2　Effect of temperature on extraction yieldof polysaccharides

2.1.2提取溫度對多糖得率的影響由圖2可知，多糖的得率隨溫度的升高而升高。溫度較低時，多糖溶出緩慢，當溫度大于70℃時，多糖得率明顯增加，但繼續(xù)增高溫度多糖的得率增加緩慢，這可能因為高溫會破壞多糖結構［14］，并且溫度過高會消耗能量，故選擇提取溫度為80℃左右較為合理。

圖3　提取時間對多糖得率的影響Fig.3　Effect of time on extraction yield of polysaccharides

2.1.3提取時間對多糖得率的影響由圖3可知，多糖得率隨時間的增加而增加。提取時間較短時，多糖溶出不完全，當提取時間為2～3 h時多糖的提取量明顯增加，但繼續(xù)延長提取時間，多糖的提取量趨于平穩(wěn)，出于節(jié)約時間的考慮，選取提取時間為3 h左右。

圖4　提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.4　Effect of extraction on extraction yield of polysaccharides

2.1.4提取次數(shù)對多糖得率的影響由圖4可知，多糖得率隨提取次數(shù)的增加而呈先增加后趨于平緩的趨勢。當提取次數(shù)小于3次時，多糖得率增加明顯，提取4次時，多糖得率達到最大值，當?shù)?次提取后得率基本保持平穩(wěn)，這可能是因為多糖的提取量已達最大值，繼續(xù)提取不會增加得率，反而增加時間和原料的消耗，故選擇提取3次。

2.2BBD實驗結果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1BBD實驗設計方案及結果根據(jù)單因素實驗結果，由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示，以蘿藦果殼多糖得率為響應值，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，建立四因素三水平中心組合實驗設計共包括29個實驗方案，其中24個析因實驗點，5個中心實驗點，用以計算實驗誤差。

表2　響應面實驗設計及多糖得率Table 2　RSM design and polysaccharides yield

2.2.2回歸方程擬合及方差分析采用Design Expert8.0.6統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸分析結果見表3，對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

表3　回歸模型及方差分析Table 3　Analysis of variance of regression equation

回歸模型的R2=0.9762，R2Adj=0.9523，由方差分析可知回歸方程模型極顯著（p＜0.0001），說明該模型與實際擬合良好，實驗方法可靠，失擬項不顯著（p＞0.05），說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。結果表明，料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）、料液比與提取溫度交互項（AB）、提取溫度與提取時間交互項（BC）、料液比二次項（A2）、提取溫度二次項（B2）、提取時間二次項（C2）、提取次數(shù)二次項（D2）對響應值影響顯著，各因素對響應值顯著性的排序為B＞A＞D＞C。

2.2.3響應面圖分析響應面法是優(yōu)化存在多因素影響實驗條件的尋優(yōu)方法，通過固定數(shù)量的實驗次數(shù)可以連續(xù)的對實驗因素進行分析，并得到直觀的3D曲面圖進而評價各因素間的交互作用［15-16］。根據(jù)軟件Design-Expert獲得響應值的3D曲面，分析各因素對多糖得率的影響及各因素間的交互作用。圖5中所示為當固定料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)中任意兩個因素為零水平時，其余兩個因素間的交互作用及對多糖得率的影響。多糖得率隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢，達到某一定值時，曲面稍下降或趨于平緩。結果如圖5（a～f）所示，其中圖5（a）和圖5（b）曲面陡峭，說明料液比和提取溫度、提取溫度和提取時間之間交互作用較明顯，與方差分析結果相符。

圖5　兩因素的交互作用對多糖得率的響應面圖Fig.5　Response surface plots of variable parameters on the yield of polysaccharides

圖5（a）所示為固定提取時間和提取次數(shù)為零水平，料液比和提取溫度對多糖得率的影響和兩者之間的交互作用。料液比較低時，得率隨提取溫度增加呈先上升后平緩下降的趨勢，料液比較高時，得率隨溫度增加先上升，達到某一定值時趨于平緩；固定提取溫度不變時，多糖得率隨料液比增加呈先上升后平緩下降的趨勢。綜合響應面圖可以看出，提取溫度上升的幅度較料液比稍陡峭，說明提取溫度對多糖得率的影響較料液比稍大。圖5（b）所示為固定料液比和提取次數(shù)為零水平，提取溫度和提取時間對多糖得率的影響和兩者之間的交互作用。多糖得率隨提取溫度和提取時間的增加呈先上升后平緩下降的趨勢，且提取溫度的上升幅度明顯大于提取時間的上升幅度，說明提取溫度對多糖得率的影響較大。

2.2.4驗證實驗對回歸方程求解，即得率達到最大值時的提取條件為料液比為1∶17.87、提取溫度為86.32℃、提取時間為2.9 h、提取次數(shù)為2.95次，最大多糖得率達到11.18%，為方便實際操作將實驗條件定為料液比為1∶18、提取溫度為86℃、提取時間為3 h、提取次數(shù)為3次。取三等份蘿藦果殼多糖的干燥粉末進行平行驗證實驗，驗證實驗所得平均得率為11.22%，平均多糖含量為26.91%。結果表明，經(jīng)過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合，證明用響應面法可以有效的優(yōu)化蘿藦果殼多糖提取工藝。

2.2.5DPPH·清除率測定結果DPPH·具有單電子，在517 nm處有強吸收，其醇溶液呈紫色，當體系中加入抗氧化性物質(zhì)時，該物質(zhì)能與DPPH·的單電子配對，使其吸收逐漸消失，進而評價清除劑的清除能力［17］。蘿藦果殼多糖對DPPH·的清除作用結果如圖6所示，以VC作為對照，在濃度低于1 mg/mL時，蘿藦果殼多糖對DPPH·的清除作用隨多糖濃度的增加呈遞增趨勢，大于1 mg/mL后，多糖清除DPPH·的能力趨于穩(wěn)定，多糖濃度為4 mg/mL時清除作用達到最大值73.01%，結果表明蘿藦果殼多糖具有較好的清除DPPH·自由基的作用。

圖6MJNP對DPPH·的清除作用Fig.6　DPPH radical-scavenging activities of MJNP

2.2.6O2-清除率測定結果體外生成O2-的方法為鄰苯三酚法，其本質(zhì)是鄰苯三酚在堿性環(huán)境中發(fā)生自氧化鏈式反應并釋放大量的O2，O2又進一步加速鄰苯三酚氧化，生成一系列在可見光區(qū)有特征吸收的中間產(chǎn)物，若反應體系中加入抗氧化物質(zhì)，在325 nm處的吸光度變小，進而間接評價其抗氧化活性［18］。蘿藦果殼多糖清除O2-的作用結果如圖7所示，多糖濃度在0～1 mg/mL之間時，清除O2-的能力明顯遞增，但多糖濃度1 mg/mL時O2-清除率達到最大值80.61%，隨后清除率趨于平穩(wěn)，說明蘿藦果殼多糖有較好的清除O2-的能力。

圖7　MJNP對O2-的清除作用Fig.7　O2-radical-scavenging activities of MJNP

2.2.7·OH清除率測定結果·OH是一種氧化能力很強的活性氧自由基，會使機體產(chǎn)生氧化損傷，與多種疾病的發(fā)生有關。體外生成·OH的方法為Fenton反應，其實質(zhì)是H2O2在Fe2+的催化作用下生成具有高反應活性的羥自由基（·OH），水楊酸能有效捕捉·OH并生成有色物質(zhì)，在510 nm處有最大吸收，當加入具有清除作用的物質(zhì)時會使510 nm處的吸光度降低，進而評價其抗氧化能力［19］。蘿藦果殼多糖清除·OH的能力如圖8所示，清除能力隨多糖濃度增加而增加，濃度達到0.5 mg/mL后清除率能達到50%左右，說明蘿藦果殼多糖具有一定的清除·OH作用，但清除能力明顯低于陽性對照組VC。

圖8MJNP對·OH的清除作用Fig.8·OH radical-scavenging activities of MJNP

3　結論

采用響應面法對蘿藦果殼多糖的提取條件進行優(yōu)化，建立了多糖得率的回歸模型，由該模型優(yōu)化的多糖提取條件為料液比1∶18、提取溫度86℃、提取時間3 h、提取次數(shù)3次。此條件下，蘿藦果殼多糖的平均得率為11.22%，與模型預測結果相近，進一步驗證了該模型的可靠性。通過苯酚-硫酸法測定最優(yōu)工藝條件下制備的多糖中總糖含量為26.91%，高于前期研究。這可能因為提取時間、提取次數(shù)及提取溫度較前期研究均有提高，多糖得率增加，故多糖百分含量較高。抗氧化活性實驗表明蘿藦果殼多糖對DPPH·、O2-、·OH均具有一定的清除能力，其中對O2-、DPPH·清除作用明顯，說明蘿藦果殼多糖具有較好的抗氧化活性。

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Optimization of extraction process of polysaccharides from Metaplexis japonica Makino nutshell and evaluation of antioxidative activity

BAI Yu-xin1，GUO Bin2，*，HAN Guan-ying2，CUI Zan2
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2.The NO.1 Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

Based on the single factor experiments，the response surface methodology（RSM）was employed to optimize the extraction conditions of polysaccharides from Metaplexis japonica Makino nutshell（MJNP）and its antioxidant activity was primarily evaluated.The results of optimum extraction conditions were as follow：the ratio of water to raw material 1∶18（g/mL），extraction temperature 86℃，extraction time 3 h and number of extraction 3 times.Under these conditions，the average extraction yield was 11.22%.The results of antioxidation experiments showed that the highest scavenging capacity of polysaccharides against O2-，DPPH was 80.61%，73.01%respectively.The optimization of MJNP extraction process technology was reasonable and feasible，MJNP had stronger antioxidant activity.

Metaplexis japonica Makino nutshell；polysaccharide；response surface；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0278-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.049

2015－03－01

白雨鑫（1990-），女，碩士研究生，研究方向：多糖物質(zhì)的研究，E-mail：15134156949@163.com。

郭斌（1969-），男，教授，研究方向：海洋藥物資源的開發(fā)研究，E-mail：jyguobin@126.com。

遼寧省科技廳科技攻關計劃（2013225305）。