霍歡歡，柳相鶴，史吉平，劉志文，張保國，*（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海0110）

纖細(xì)裸藻Δ9-脂肪酸延長酶基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)

霍歡歡1，2，柳相鶴2，史吉平2，劉志文1，*，張保國2，*
（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210）

從纖細(xì)裸藻cDNA中克隆出Δ9-脂肪酸延長酶基因，與解脂耶氏酵母整合載體pINA1297連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pINA1297-Δ9E，用電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母中，篩選得到陽性表達(dá)菌株YLΔ9E。在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)（YPD）條件下，工程酵母YLΔ9E的菌體生長速率高于對照菌株polf。對工程酵母YLΔ9E進(jìn)行脂肪酸成分分析，結(jié)果表明Δ9-脂肪酸延長酶基因獲得表達(dá)，產(chǎn)生了二十碳二烯酸（EDA），其含量可高達(dá)14.8%。

纖細(xì)裸藻，Δ9-脂肪酸延長酶，二十碳二烯酸，解脂耶氏酵母

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是指含有2個或者2個以上雙鍵的長鏈脂肪酸，碳原子數(shù)目一般為18～22個。除了作為結(jié)構(gòu)成分和信號分子，對維持細(xì)胞膜正常功能和一些基本的細(xì)胞過程具有重要的調(diào)節(jié)作用外，還具有重要的生理功能，如降低心血管疾病風(fēng)險、提高免疫力、抗癌等［1-3］。因此，PUFAs的生物合成以及合成途徑中的一些關(guān)鍵酶受到廣泛的關(guān)注，PUFAs的合成從硬脂酸（Stearic acid，SA）開始，經(jīng)過一系列的脫氫和延長反應(yīng)，形成各種不同的PUFAs，主要包括Δ-6脫氫酶合成途徑和Δ9-延長酶合成途徑［4］。目前，已經(jīng)有多個PUFAs合成途徑中的關(guān)鍵酶基因如：Δ5-脂肪酸脫氫酶基因、Δ8-脂肪酸脫氫酶基因、ω-3脂肪酸去飽和酶基因等在不同模式微生物中成功表達(dá)［5-8］。

Δ9-脂肪酸延長酶（Δ9E）是Δ9-延長酶合成途徑中第一個關(guān)鍵酶，它可以將亞油酸（LA，C18∶2n-3）轉(zhuǎn)化為二十碳二烯酸（Eicosadienoic acid；EDA），EDA又可以通過相關(guān)酶的作用合成為其他功能性的PUFAs，如二高-γ-亞油酸（DGLA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等［9］。另外，EDA是白三烯B4受體拮抗物，對于輕度哮喘、過敏性鼻炎有很好的治療效果［10］。同時母乳中n-6型PUFAs，如EDA、γ-亞麻酸含量較高時，會相應(yīng)的降低嬰兒被母親傳染HIV的幾率［11］。因此，PUFAsΔ9-延長酶合成途徑中的關(guān)鍵酶基因Δ9E是重要的研究對象，利用基因工程手段提高Δ9E基因的表達(dá)活性，對于構(gòu)建高產(chǎn)EDA工程菌株及研究PUFAs合成路徑中相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

解脂耶氏酵母（Yarrowa Lipolytica）是一種非常規(guī)酵母，被認(rèn)為是安全的（GRAS：generally regarded as safe），因此能夠用于食品生產(chǎn)，同時解脂耶氏酵母的基因操作平臺已經(jīng)建立，使得基因敲除及其他分子水平的操作或研究成為可能［12-15］。作為產(chǎn)油酵母，解脂耶氏酵母可以在胞內(nèi)積累大量的油脂，某些情況下油脂積累量可超過其自身干重的50%［16］。但是由于野生型解脂耶氏酵母沒有較為完整多不飽和脂肪酸合成途徑，只能從頭合成亞油酸（C18∶2n），而不能夠合成其他重要的PUFAs，因此通過基因工程手段改造解脂耶氏酵母使其作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)具有重要生物活性的PUFAs（如：EDA、GLA、DHA、ARA、EPA等）具有重要的意義［17-19］。本研究擬將纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）Δ9E基因轉(zhuǎn)入解脂耶氏酵母中，研究該基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)，建立目的基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)體系，為今后通過基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)PUFAs解脂耶氏酵母菌株打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）FACHB-849中國科學(xué)院淡水藻種庫；大腸桿菌DH5α本實驗室保藏；質(zhì)粒pINA1297和解脂耶氏酵母polf（leucine-，uracil-）均由法國國家科學(xué)研究中心微生物學(xué)和分子遺傳學(xué)實驗室的Catherine Madzak教授贈送；PCR克隆載體pMD19-T simple載體TaKaRa公司；KOD DNA聚合酶ToYoBo公司；T4 DNA連接酶及PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒TaKaRa公司；YNB（Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids）Simga公司；DNA限制性內(nèi)切酶Thermo公司；TRIzol試劑Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Reverse Transcription System）Promega公司；其他常規(guī)試劑國產(chǎn)分析純；引物合成和測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；YPD培養(yǎng)基1%葡萄糖、1%酵母粉、1%蛋白胨；YNBcasa培養(yǎng)基1%葡萄糖、0.67%YNB、75 mg/mL亮氨酸；LB培養(yǎng)基0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%NaCl；HTC培養(yǎng)基KH2PO40.02 g/L，蛋白胨0.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，酵母抽提液0.4 g/L，乙酸鈉0.4 g/L，維生素B120.5 μg/L，檸檬酸鉀0.04 g/L，維生素B10.04 mg/L。

S1000 PCR儀、Gel Dox XR+凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac Basic核酸電泳儀美國BIO-RAD公司；Centrifuge 5430低溫離心機(jī)德國Eppendorf公司；DU730紫外分光光度計德國Beckman；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城儀器制造有限公司；GC-MS HP6890氣相色譜、HP5973質(zhì)譜美國安捷倫公司；光照培養(yǎng)箱上海飛域?qū)嶒炇以O(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）Δ9脂肪酸延長酶基因（Δ9E）片段的克隆采用TRIzol試劑法，提取纖細(xì)裸藻的總RNA，利用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)纖細(xì)裸藻Δ9E基因（GenBank登錄號：FW504137）序列［20］設(shè)計引物：EgΔ9EF-5’-GCCTAGGCATGGAGGTGGTGAATGAAATAGTC-3’（下劃線為Bln1酶切位點(diǎn)）；EgΔ9ER-5’-CGGATCCG CTGAATCTTTTTGGCTC CCTTGT-3’（下劃線為BamH1酶切位點(diǎn)）。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有酶切位點(diǎn)的目的片段。PCR擴(kuò)增條件為：94℃5 min；94℃30 s，57℃35 s，72℃1.5 min，30個循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以100 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB平板篩選陽性克隆子。通過菌落PCR、酶切驗證，送金唯智生物科技有限公司測序，克隆質(zhì)粒名為pMD-Δ9E。

1.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pINA1297-Δ9E的構(gòu)建將構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD-Δ9E和質(zhì)粒pINA1297同時經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切，純化回收片段后，用T4 DNA連接酶將Δ9E基因片段與pINA1297相連，得到質(zhì)粒pINA1297-Δ9E，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR、酶切驗證及測序分析后得到重組表達(dá)質(zhì)粒pINA1297-Δ9E。

1.2.3解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化及陽性重組子的篩選與鑒定利用限制性內(nèi)切酶BglⅡ?qū)⒅亟M表達(dá)質(zhì)粒pINA1297-Δ9E線性化，以電轉(zhuǎn)化法將線性化的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母polf感受態(tài)細(xì)胞［21］。由于解脂耶氏酵母polf是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的菌株，將含有尿嘧啶篩選標(biāo)記基因的重組表達(dá)載體pINA1297-Δ9E轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母polf后，以尿嘧啶營養(yǎng)缺陷的YNBcasa平板篩選陽性克隆，通過提取陽性克隆的基因組，利用引物P1-5’-ATG GAGGTGGTGAATGA AATAGTC-3’；P2-5’-CTGAATCTTTTTGGCTCCCT TGT-3’進(jìn)行PCR驗證及測序分析，獲得相應(yīng)的基因工程酵母，命名為解脂耶氏酵母YL-Δ9E。

1.2.4生長曲線測定將活化后的對照菌株polf和工程酵母YLΔ9E單克隆分別接種于5 mL的YPD培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600值約為0.5時轉(zhuǎn)接至100 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)，每4 h取樣，于波長600 nm處測定吸光度，測定時確保OD600值在0.2～0.8之間。

1.2.5生物量的測定當(dāng)對照菌株polf和工程酵母YLΔ9E處于生長穩(wěn)定期時，在104r/min下離心10 min，分別收集菌體，用去離子水清洗兩次后，再次離心收集菌體，真空冷凍干燥后用于生物量的測定。

式中，W0為空瓶重，W1為干菌體重量，V為菌體總體積。

1.2.6油脂含量測定將對照菌株解脂耶氏酵母polf和工程酵母YLΔ9E分別接種到500 mL三角瓶裝有100 mL的YPD的液體培養(yǎng)基中，在30℃和200 r/min培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定后期，離心收集菌體，真空冷凍干燥后得到干菌體，利用Folch方法提取油脂［22］。取1 g酵母干菌體，加入5 mL氯仿∶甲醇（2∶1），置于35℃水浴振蕩1 h后，離心，取出上清保存，繼續(xù)向殘存的菌體中加入5 mL氯仿∶甲醇（2∶1），置于35℃水浴振蕩1 h后，離心，取出上清。將兩次的上清液混合后，加入3 mL蒸餾水，離心后，油脂留在下層有機(jī)相中，取出下層有機(jī)相，使用氮吹儀將有機(jī)溶劑吹干至恒重，稱重并計算油脂含量。

式中，W0為空瓶重，W1為凍干的菌體重量，W2為裝有油脂的瓶重。

1.2.7脂肪酸組分分析分別稱取約25 mg酵母粉末于酯化瓶中，加入2 mL含2%硫酸的甲醇溶液。充氮?dú)夂螅?2℃水浴鍋酯化反應(yīng)1 h，酯化反應(yīng)結(jié)束后，向酯化瓶中分別加入1 mL去離子水和1 mL正己烷，充分混勻，然后在6000 r/min下離心10 min，收集上清液至樣品瓶中，氮?dú)鉂饪s后用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析［23］。

GC-MS檢測中，進(jìn)樣量為1 μL，色譜柱的型號為DB-FFAP，進(jìn)樣口溫度為240℃。升溫程序如下：進(jìn)樣后在50℃保持1 min，之后以12℃/min的速率升到180℃，保持2 min后，以6℃/min的速率上升到220℃停留2 min后，以15℃/min的速率上升到240℃保持1 min后，以15℃/min的速率達(dá)到最終溫度260℃，并在此保持15 min。氣相色譜與質(zhì)譜之間的連接溫度為280℃，用高純氮?dú)猓? mL/min）作載氣。質(zhì)譜儀采用電子電離（EI）方式，電子能量為70 eV。采用面積歸一法計算不同單體脂肪酸相對組百分含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），顯著性水平設(shè)為0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1△9-脂肪酸延長酶基因（△9E）片段的克隆與分析

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的纖細(xì)裸藻Δ9E基因序列（GenBank登錄號：FW504137）設(shè)計引物，以纖細(xì)裸藻cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)展目的片段，電泳結(jié)果如圖1所示，（圖1中泳道1）表明克隆條帶與預(yù)期大小（Δ9E：774）相一致。經(jīng)TA克隆構(gòu)建至載體pMD-19T后得到質(zhì)粒pMD-Δ9E，經(jīng)測序驗證，表明其序列與該基因的目的片段完全一致。

圖1　纖細(xì)裸藻Δ9E基因的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切凝膠電泳圖Fig.1　Electrophoresis patterns of cDNA amplified product of Euglena gracilis Δ9E gene and the endonuclear restrictive digestion of the recombinant vectors

2.2△9-脂肪酸延長酶基因（△9E）重組表達(dá)載體pINA1297-△9E的構(gòu)建

將構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pMD-Δ9E和載體pINA1297（見圖1泳道2）同時經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切，純化后，用T4 DNA連接酶將Δ9E基因目的片段與pINA1297連接得到重組質(zhì)粒pINA1297-Δ9E，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆經(jīng)菌落PCR、提取質(zhì)粒（圖1泳道3）、酶切驗證（圖1泳道4、泳道5）及測序確認(rèn)，圖1結(jié)果顯示，pINA1297-Δ9E質(zhì)粒經(jīng)BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切產(chǎn)生約5.3、0.7 ku兩條帶，說明已成功地將Δ9E基因的ORF構(gòu)建到pINA1297載體的hpd4和XPR雙啟動子下游（見圖3）。

圖2　重組質(zhì)粒pINA1297-Δ9E的構(gòu)建Fig.2　Construction of recombinant plasmids pINA1297-Δ9E

圖3　轉(zhuǎn)Δ9E基因解脂耶氏酵母的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3　Electrophoresis pattern of amplified product from the transgenic Yarrowa Lipolytica containing recombinant vector pINA1297-Δ9E

2.3重組表達(dá)質(zhì)粒pINA1297-△9E轉(zhuǎn)化與篩選

pINA1297-Δ9E載體上有編碼尿嘧啶的URA3基因，在被整合到解脂耶氏酵母polf（leucine-，uracil-）后，可以表達(dá)并產(chǎn)生尿嘧啶供酵母的生長。因此將重組表達(dá)載體pINA1297-Δ9E經(jīng)線性化處理后轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母polf，經(jīng)過YNBcasa平板篩選得到重組解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化子。將篩選得到的陽性克隆，在不含尿嘧啶的YNBcasa培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10代，發(fā)現(xiàn)所篩選的轉(zhuǎn)化子仍能夠在不含尿嘧啶的YNBcasa培養(yǎng)基上生長，表明重組表達(dá)載體pINA1297-Δ9E已經(jīng)插入酵母基因組中并隨著菌體的生長能夠穩(wěn)定的遺傳。

提取酵母基因組總DNA并作為模板，用目的片段所連接的部分載體基因序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，得到約774 bp的電泳帶，測序結(jié)果表明與克隆的目的基因序列完全一致，證明重組表達(dá)載體已經(jīng)成功整合入酵母基因組DNA中。

2.4轉(zhuǎn)△9E基因脂耶氏酵母YL△9E細(xì)胞的生長情況

YPD液體平行培養(yǎng)對照菌株polf和過表達(dá)Δ-9脂肪酸延長酶基因的工程酵母YLΔ9E繪制生長曲線，結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，工程酵母YLΔ9E的生長速率顯著高于對照菌株polf（p＜0.05）。分析原因可能是工程酵母YLΔ9E中過表達(dá)了編碼尿嘧啶的URA3基因，自身可產(chǎn)生尿嘧啶供酵母的生長。對照菌株polf由于尿嘧啶基因缺陷，自身不能產(chǎn)生尿嘧啶，而YPD培養(yǎng)基中沒有充足的尿嘧啶維持菌株更好的生長，因此工程酵母YLΔ9E的生長速率顯著高于對照菌株polf。當(dāng)兩株菌分別達(dá)到穩(wěn)定期時，菌株polf和YLΔ9E的生物量分別達(dá)到9.5 g·L-1和10.2 g·L-1。

圖4　轉(zhuǎn)基因和野生型解脂耶氏酵母生長曲線Fig.4　Comparisons of growth curves of the transgenic Yarrowa Lipolytica（YLΔ9E）and polf

2.5轉(zhuǎn)△9E基因脂耶氏酵母YL△9E脂肪酸成分分析

由表1可知，工程酵母YLΔ9E細(xì)胞中油脂含量為8.3%，與對照菌株polf相比沒有顯著差異，表明在解脂耶氏酵母中過表達(dá)Δ9E基因并不能提高其油脂總含量。GC-MS分析結(jié)果表明，工程酵母YLΔ9E在25.57 min左右中出現(xiàn)了一個新的脂肪酸峰，經(jīng)鑒定為二十碳二烯酸（EDA）（見圖5），表明纖細(xì)裸藻Δ9-脂肪酸延長酶基因在解脂耶氏酵母polf中獲得表達(dá)，其表達(dá)量占總脂肪酸的14.8%左右（見表1）。EDA的出現(xiàn)與亞油酸（C18∶2）和十八碳一烯酸（C18∶1）含量的降低呈明顯的一致關(guān)系，對照菌株中亞油酸和十八碳一烯酸含量分別為24.75%和44.09%，而轉(zhuǎn)基因菌株中，亞油酸和十八碳一烯酸含量分別減少至16.92%和39.9%。

表1　轉(zhuǎn)基因解脂耶氏酵母YLΔ9E細(xì)胞脂肪酸組成分析Table 1　Fatty acid compositions of total lipid from transgenic Yarrowa Lipolytica YLΔ9E

3　結(jié)論與討論

本研究借助于質(zhì)粒pINA1297將纖細(xì)裸藻（Euglena gracilis）Δ9-脂肪酸延長酶基因整合到導(dǎo)入解脂耶氏酵母polf中。pINA1297是一種整合型表達(dá)質(zhì)粒，無需加入誘導(dǎo)劑，避免了對誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時間和溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化的繁瑣工作，使目的基因的表達(dá)更高效方便。通過營養(yǎng)缺陷性篩選、PCR驗證，結(jié)果表明目的基因已經(jīng)整合到解脂耶氏酵母基因組中，進(jìn)一步利用GC-MS對轉(zhuǎn)基因酵母中單體脂肪酸種類進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果表明：由于野生解脂耶氏酵母polf中含有比較豐富的油酸，所以當(dāng)外源Δ9-脂肪酸延長酶基因轉(zhuǎn)入后，轉(zhuǎn)基因菌株可以將內(nèi)源的油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸，亞油酸在總油脂中的含量達(dá)到約14%左右，表明纖細(xì)裸藻Δ9-脂肪酸延長酶在解脂耶氏酵母中獲得了功能表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因菌株中油酸的含量仍然有17%左右，表明可能是由于轉(zhuǎn)入的Δ9-脂肪酸延長酶基因表達(dá)活性不高，不能夠?qū)⒏嗟挠退徂D(zhuǎn)化為亞油酸。因此，下一步工作應(yīng)該對轉(zhuǎn)入的Δ9-脂肪酸延長酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使用強(qiáng)啟動子等方法提高外源基因在解脂耶氏酵母中更加高效的表達(dá)。本研究將在進(jìn)一步的實驗中繼續(xù)表達(dá)PUFAs合成途徑中關(guān)鍵酶基因，為日后以解脂耶氏酵母作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)PUFAs提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

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Expression of Euglena gracilis△9 fatty acid elongase gene in Yarrowa Lipolytica

HUO Huan-huan1，2，LIU Xiang-he2，SHI Ji-ping2，LIU Zhi-wen1，*，ZHANG Bao-guo2，*
（1.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.Lab of Biorefinery，Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201210，China）

The△9-fatty acid elongase was cloned from cDNA of the Euglena gracilis.The sequence from cDNA was ligated into pINA1297，yielding the recombinant pINA1297-△9E.Yarrowa Lipolytica Po1f was transformed with pINA1297-△9E by electroporation method and the positive transformants YL△9E were obtained by YNBcasa plates.The growth rate of transgenic strains was much higher than that of wild strain in YPD medium. Analysis of gas chromatography/mass spectrometer（GC-MS）showed that eicosadienoic acid（EDA；C20∶2n-6）

Euglena gracilis；△9-fatty acid elongase；eicosadienoic acid；Yarrowa Lipolytica

TS201.3

A

1002-0306（2015）20-0183-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.030

2015－01－22

霍歡歡（1989-），女，碩士研究生，研究方向：微生物油脂代謝調(diào)控，E-mail：huohuanhuan540@126.com。

劉志文（1972-），男，博士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：alzw@dlpu.edu.cn。張保國（1979-），男，博士研究生，研究方向：微生物油脂代謝調(diào)控，E-mail：zhangbg@sari.ac.cn。

國家自然科學(xué)基金項目（41106125）。

was detected and their percentage to total fatty acids in transgenic Yarrowa Lipolytica was 14.8%，which indicated that Euglena gracilis△9-fatty acid elongase gene was expressed in transgenic Yarrowa Lipolytica.