任仙娥，楊　鋒，*，黃永春，楊德華，黃　雪（.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006）

乙?；男詫?duì)米渣蛋白功能性質(zhì)的影響

任仙娥1，2，3，楊鋒1，2，3，*，黃永春1，2，3，楊德華1，黃雪1
（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006）

采用乙?；瘜?duì)米渣蛋白進(jìn)行改性，研究了米渣蛋白在乙酰化改性過(guò)程中巰基和二硫鍵含量、表面疏水性、溶解性以及乳化性的變化。結(jié)果表明，隨改性程度的增加，米渣蛋白中暴露巰基含量逐漸增加，總游離巰基含量逐漸下降，二硫鍵含量逐漸增加，表面疏水性先下降后升高。乙?；男院蟮拿自鞍自趐H5～10范圍內(nèi)的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性明顯增加，但是pH2～4范圍內(nèi)的溶解性和乳化活性卻有所降低?？梢?jiàn)，乙?；男阅芨纳泼自鞍椎牟糠止δ苄再|(zhì)。

乙酰化改性，米渣蛋白，功能性質(zhì)

對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性的方法主要有物理改性、化學(xué)改性和生物學(xué)改性等。筆者曾采用水力空化技術(shù)對(duì)米渣蛋白進(jìn)行改性，發(fā)現(xiàn)水力空化在一定條件下能改善米渣蛋白的部分功能性質(zhì)［3］。乙?；男允堑鞍踪|(zhì)化學(xué)改性中常用的手段，研究表明乙?；男阅苡行У馗纳频鞍踪|(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)。如大豆分離蛋白經(jīng)乙?；男院笃淙芙庑?、乳化性和起泡性明顯提高［4］，蠶蛹蛋白經(jīng)乙?；男院笕芙庑员雀男郧疤岣吡?9.27%［5］，乙?；男院蟮拿娼畹鞍踪|(zhì)溶解性、乳化能力和起泡能力均得到了提高［6］?；诖?，本文采用乙?；瘜?duì)米渣蛋白進(jìn)行改性，研究乙?；男詫?duì)米渣蛋白溶解性和乳化性的影響，以及乙?；男赃^(guò)程中米渣蛋白暴露巰基、游離巰基、二硫鍵含量的變化和表面疏水性的變化情況，為拓寬米渣蛋白的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

濕米渣（經(jīng)測(cè)定含水量為49.5%） 廣西柳州順意來(lái)生物科技有限公司；福林酚試劑、牛血清白蛋白、5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANSA）上?？笊锛夹g(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

722分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；100LK高剪切混合乳化頭上海威宇機(jī)電制造有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機(jī)Beckman Coulter公司；F-320熒光分光光度計(jì)天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1米渣蛋白的制備采用堿提酸沉法提取米渣蛋白。稱(chēng)取100 g濕米渣，加入2000 mL pH10.0的NaOH溶液，于40℃下攪拌提取4 h，5000 r/min離心分離10 min，取上清液用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至4.5，靜置，5000 r/min離心分離10 min取沉淀，用200 mL蒸餾水水洗沉淀2次，再用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，冷凍干燥，所得產(chǎn)品即為米渣蛋白［3］。經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量為70.4%，可能還含有淀粉、糊精等多糖類(lèi)成分。

1.2.2乙?；男悦自鞍讌⒄瘴墨I(xiàn)［7］的方法，稍作修改，具體操作方法如下：稱(chēng)取3 g米渣蛋白分散于100 mL蒸餾水中，配制成濃度為3%（w/v）蛋白分散液，再用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，逐漸加入適量乙酸酐，并維持分散液的pH在7.5～8.5，待分散液的pH穩(wěn)定在8.0后，繼續(xù)反應(yīng)1 h，使米渣蛋白與乙酸酐的?；磻?yīng)完全，整個(gè)過(guò)程控制反應(yīng)溫度在40℃。反應(yīng)結(jié)束后，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4～4.5，于5000 r/min離心10 min，棄上清液，取沉淀，沉淀經(jīng)100 mL蒸餾水水洗2次后冷凍干燥，即得乙酰化米渣蛋白。分別添加0.06、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9 g乙酸酐，使乙酸酐與米渣蛋白配比分別在0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/g，進(jìn)行乙酰化反應(yīng)來(lái)制備不同改性程度的米渣蛋白。

牢固樹(shù)立生態(tài)文明理念，切實(shí)保護(hù)土地資源，合理利用土地資源，建設(shè)友好型草牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展生態(tài)環(huán)境。優(yōu)化生態(tài)環(huán)境，科學(xué)配置資源，建設(shè)和完善草牧業(yè)生產(chǎn)防護(hù)體系，構(gòu)筑生態(tài)安全屏障，為草地安全生產(chǎn)保駕護(hù)航。挖掘草地生產(chǎn)資源，科學(xué)規(guī)劃草地建設(shè)，因地制宜，綜合措施，變資源優(yōu)勢(shì)為經(jīng)濟(jì)發(fā)展優(yōu)勢(shì)。協(xié)調(diào)草地生產(chǎn)與生態(tài)建設(shè)關(guān)系，建設(shè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境保護(hù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)草產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。

1.2.3米渣蛋白乙?；男猿潭鹊臏y(cè)定采用茚三酮比色法，參照文獻(xiàn)［8］測(cè)定米渣蛋白的乙?；男猿潭取＞唧w測(cè)定方法為：將米渣蛋白樣品用蒸餾水配制成濃度為1%（w/v）的蛋白溶液，取1 mL于10 mL比色管中，加入0.1%的茚三酮溶液，再加入1 mL pH8.0磷酸鹽緩沖液，混合后在100℃的沸水浴中加熱15 min，冷卻，加水至10 mL。以蒸餾水代替蛋白溶液作為空白，測(cè)定其在580 nm處的吸光度。以此方法分別測(cè)出乙?；男郧昂竺自鞍讟悠返奈舛?，再按下式計(jì)算米渣蛋白乙?；男猿潭?。

乙?；男猿潭龋?）=（未改性的米渣蛋白吸光度-改性后的米渣蛋白吸光度）/未改性的米渣蛋白吸光度×100

1.2.4米渣蛋白溶解性的測(cè)定稱(chēng)取100 mg米渣蛋白樣品，溶于10 mL蒸餾水中，再用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH分別至2～10，然后置于振蕩器中振搖30 min，使其充分溶解，再于10000 r/min離心10 min，取上清液以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)采用福林-酚比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量［9］，以上清液中蛋白質(zhì)含量（mg/mL）來(lái)表示米渣蛋白的溶解性。

1.2.5米渣蛋白乳化性的測(cè)定配制0.1%（w/v）的米渣蛋白溶液，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH分別至2～10，再參照文獻(xiàn)［10］采用經(jīng)典的比濁法，分別測(cè)定不同改性程度的米渣蛋白在pH2～10范圍內(nèi)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。

1.2.6米渣蛋白巰基和二硫鍵含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)［11］，分別測(cè)定不同改性程度的米渣蛋白的總游離巰基、暴露巰基和二硫鍵的含量。

1.2.7米渣蛋白表面疏水性的測(cè)定采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定不同改性程度的米渣蛋白的表面疏水性，參照文獻(xiàn)［12］，略作修改，具體操作方法如下：將不同改性程度的米渣蛋白樣品用0.01 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液分別配制成濃度為0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的蛋白溶液，取蛋白溶液4 mL，加入10 μL、8 mmol/L的ANSA，混合均勻后靜置3 min。在熒光分光光度計(jì)下，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)384 nm、發(fā)射波長(zhǎng)450 nm，狹縫寬5 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。用熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白溶液濃度作圖并進(jìn)行線(xiàn)性回歸，以線(xiàn)性回歸斜率作為表面疏水性指數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1不同改性程度米渣蛋白的制備

蛋白質(zhì)的?；磻?yīng)主要是蛋白分子中的親核基團(tuán)攻擊酸酐羰基碳原子所誘發(fā)的一類(lèi)親核取代反應(yīng)，賴(lài)氨酸的ε-氨基、脂肪族氨基酸的羥基以及巰基均可以參加乙?；磻?yīng)，其中賴(lài)氨酸的ε-氨基其親核能力強(qiáng)、空間位阻小，參與乙?；磻?yīng)的活性較強(qiáng)［13］。在一定條件下，蛋白質(zhì)的?；男猿潭扰c酸酐的種類(lèi)和用量有關(guān)，因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)乙酸酐與米渣蛋白的配比來(lái)制備不同改性程度的米渣蛋白，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)乙酸酐與米渣蛋白的配比小于0.1 g/g時(shí)，米渣蛋白的乙酰化改性程度隨著二者配比的增加而不斷增加；當(dāng)配比達(dá)到0.1 g/g時(shí)，改性程度達(dá)到63.5%；當(dāng)配比繼續(xù)增加達(dá)到0.2 g/g時(shí)，改性程度也繼續(xù)增加達(dá)到84.4%；當(dāng)配比超過(guò)0.2 g/g后，改性程度增加不明顯。因此選擇配比在0.02、0.05、0.1、0.2 g/g，分別制備乙?；男猿潭葹?6.4%、48.1%、63.5%和84.4%的米渣蛋白，研究乙?；男詫?duì)米渣蛋白功能性質(zhì)的影響。

圖1　不同改性程度米渣蛋白的制備Fig.1　Preparation of different acetylation extent of rice residue protein

2.2乙?；男詫?duì)米渣蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

通過(guò)測(cè)定米渣蛋白在乙?；男赃^(guò)程中總游離巰基（包括暴露在分子表面和包裹在分子內(nèi)部的巰基）、暴露巰基（暴露在分子表面的巰基）和二硫鍵的含量變化，不僅可反映出米渣蛋白中巰基參與酰化反應(yīng)的情況，還可根據(jù)暴露巰基的變化情況反映乙?；男詫?duì)米渣蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響。如圖2所示，米渣蛋白在改性前暴露巰基含量為2.98 μmol/g，隨著改性程度的增加，暴露巰基含量逐漸升高，當(dāng)改性程度達(dá)到84.4%時(shí)，暴露巰基含量為5.54 μmol/g，說(shuō)明乙酰化改性使米渣蛋白分子伸展開(kāi)來(lái)，包埋在分子內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)。改性前總游離巰基含量為6.84 μmol/g，隨著改性程度的增加，總游離巰基含量逐漸下降，當(dāng)改性程度達(dá)到84.4%時(shí)，總游離巰基含量為5.92 μmol/g，說(shuō)明有部分巰基參與乙?；磻?yīng)或被氧化形成二硫鍵。改性前二硫鍵含量為11.5 μmol/g，隨著改性程度的增加，二硫鍵含量逐漸增加，當(dāng)改性程度達(dá)到84.4%時(shí)，二硫鍵含量為23.8 μmol/g，說(shuō)明有部分巰基被氧化形成分子間或分子內(nèi)的二硫鍵，使二硫鍵含量升高。

圖2　乙?；男詫?duì)米渣蛋白巰基和二硫鍵含量的影響Fig.2　Effect of acetylation on sulfhydryl and disulfide bond contents of rice residue protein

2.3乙酰化改性對(duì)米渣蛋白表面疏水性的影響

如圖3所示，米渣蛋白的表面疏水性隨改性程度的增加呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)，Gruener等［14］在研究油菜籽12S球蛋白乙?；男赃^(guò)程中理化性質(zhì)的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)相同趨勢(shì)；Kim等［15］在乙?；蠖沟鞍字幸灿^察到類(lèi)似結(jié)果。在改性程度小于48.1%時(shí)，米渣蛋白的表面疏水性隨改性程度的增加一直下降，其原因可能是在這個(gè)階段，賴(lài)氨酸上帶正電荷的ε-氨基被中性的乙?；〈自鞍妆砻骐姾杉眲「淖?，極性基團(tuán)出現(xiàn)頻數(shù)增加而非極性（疏水性）基團(tuán)頻數(shù)下降，以及由于極性基團(tuán)增多的排斥效應(yīng)使表面的疏水性基團(tuán)重新定向或翻轉(zhuǎn)指向于內(nèi)部的疏水性區(qū)域［16］，表現(xiàn)為表面疏水性下降。當(dāng)改性程度大于48.1%后，米渣蛋白的表面疏水性隨改性程度的增加開(kāi)始上升，在這個(gè)階段，賴(lài)氨酸的ε-氨基乙?；罅咳〈自鞍追肿幼冃陨煺归_(kāi)來(lái)（圖2中暴露巰基的增加也證實(shí)這點(diǎn)），蛋白內(nèi)部的疏水性基團(tuán)大量暴露出來(lái)，表現(xiàn)為米渣蛋白表面疏水性增加。

圖3　乙酰化改性對(duì)米渣蛋白表面疏水性的影響Fig.3　Effect of acetylation on surface hydrophobicity of rice residue protein

2.4乙?；男詫?duì)米渣蛋白溶解性的影響

米渣蛋白經(jīng)乙?；男院笤趐H2～10范圍內(nèi)的溶解性如圖4所示。未改性的米渣蛋白在pH4～5溶解性最低，其原因可能是此區(qū)域處于米渣蛋白的等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)區(qū)域時(shí)其表面凈電荷為零，分子間的靜電排斥效應(yīng)減小，分子之間易形成聚集物，表現(xiàn)為溶解性低，偏離等電點(diǎn)的區(qū)域，靜電排斥效應(yīng)增加，溶解性增加。改性后的米渣蛋白pH3～4溶解性最低。尹壽偉等［16］研究酰化對(duì)蕓豆蛋白功能性質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)酰化處理誘導(dǎo)蕓豆蛋白等電點(diǎn)區(qū)域向酸性偏移從4.5～5.0降低到3.0～4.0，與本文研究結(jié)果相似，其原因可能是帶正電荷的賴(lài)氨酸ε-氨基被電中性的乙酰根取代，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷增加，等電點(diǎn)向酸性方向偏移。在pH5～10范圍內(nèi)，米渣蛋白的溶解性隨著乙?；男猿潭鹊脑黾映霈F(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)改性程度小于63.5%時(shí)，溶解性隨改性程度的增大而增加，其原因可能是電中性的乙酰根取代了帶正電荷的氨基，使米渣蛋白表面的凈負(fù)電荷增加，靜電排斥效應(yīng)增加，抑制了米渣蛋白分子間的聚集，表現(xiàn)為溶解性增加；當(dāng)改性程度達(dá)到63.5%時(shí)，溶解性達(dá)到最大；當(dāng)改性程度繼續(xù)增加時(shí)，溶解性反而降低，結(jié)合圖3可知，當(dāng)乙?；潭雀邥r(shí)，米渣蛋白分子伸展開(kāi)來(lái)，內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性大幅增加，使溶解性降低。

圖4　乙酰化改性對(duì)米渣蛋白溶解性的影響Fig.4　Effect of acetylation on solubility of rice residue protein

2.5乙?；男詫?duì)米渣蛋白乳化性的影響

蛋白質(zhì)的乳化性可通過(guò)乳化活性和乳化穩(wěn)定性?xún)蓚€(gè)指標(biāo)來(lái)表征。研究表明，蛋白質(zhì)的乳化性與其溶解性和表面疏水性密切相關(guān)，并且當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的溶解性較低時(shí)，乳化性受溶解性的影響很大，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的溶解性較高時(shí)，乳化性則受表面疏水性的影響較大［13］。乙?；男詫?duì)米渣蛋白乳化活性的影響如圖5所示。在pH2～4時(shí)，改性后的米渣蛋白乳化活性均低于未改性的蛋白，歸因于在此pH范圍內(nèi)改性后的蛋白溶解性低于未改性的蛋白；在pH5～10時(shí)，改性后的米渣蛋白乳化活性均高于未改性的蛋白，并且隨著改性程度的增加，乳化活性也增加，其原因可能是一方面改性程度低于63.5%的蛋白溶解性比未改性的蛋白高，另一方面結(jié)合圖2和圖3來(lái)看，改性程度高于48.1%的米渣蛋白分子結(jié)構(gòu)伸展開(kāi)來(lái)，表面疏水性增加，促使乳化活性增加。

圖5　乙酰化改性對(duì)米渣蛋白乳化活性的影響Fig.5　Effect of acetylation on emulsifying activity index of rice residue protein

乙?；男詫?duì)米渣蛋白乳化穩(wěn)定性的影響如圖6所示，改性后米渣蛋白的乳化穩(wěn)定性在所試pH范圍內(nèi)得到明顯改善。Lawal［17］研究?；ㄉ鞍椎娜榛再|(zhì)和Mirmoghtadaie［18］研究?；帑湹鞍椎娜榛再|(zhì)時(shí)都得到相似結(jié)果。歸因于乙酸酐的加入使蛋白的凈負(fù)電荷增加，脂肪球周?chē)鷰щ妼有纬?，帶電層形成后?dǎo)致其在界面上與水化層相互排斥，降低了界面能量，阻礙了液滴的聚集，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性增加。

圖6　乙?；男詫?duì)米渣蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6　Effect of acetylation on emulsion stability index of rice residue protein

3　結(jié)論

米渣蛋白的乙?；男猿潭入S著乙酸酐與米渣蛋白配比的增加而不斷增加，當(dāng)酸酐蛋白比為0.2 g/g時(shí)，乙?；男猿潭瓤蛇_(dá)到84.4%，之后繼續(xù)增加酸酐蛋白比，改性程度增加不明顯。在乙酰化改性過(guò)程中，隨改性程度的增加，暴露巰基含量逐漸增加，游離巰基含量逐漸下降，二硫鍵含量逐漸增加，表面疏水性先下降后升高。改性后的米渣蛋白等電點(diǎn)向酸性方向偏移（從pH4～5偏移到pH3～4）；溶解性在pH2～4下降、pH5～10明顯增加；乳化活性在pH2～4時(shí)均低于未改性的蛋白，在pH5～10時(shí)均高于未改性的蛋白，并且隨著改性程度的增加，乳化活性也增加；乳化穩(wěn)定性在所測(cè)試的pH范圍內(nèi)得到明顯改善。由此可見(jiàn)，乙酰化改性在一定條件下能改善米渣蛋白的部分功能性質(zhì)，但是關(guān)于乙?；男詫?duì)米渣蛋白的物化特性如分子量分布、凈電荷和結(jié)構(gòu)有什么樣的影響以及結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系如何，還需進(jìn)一步研究。

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Effect of acetylated modification on the functional properties of rice residue proteins

REN Xian-e1，2，3，YANG Feng1，2，3，*，HUANG Yong-chun1，2，3，YANG De-hua1，HUANG Xue1
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes，Liuzhou 545006，China）

Acetylation was applied to modify rice residue proteins.Sulfhydryl（SH）and disulfide bond（SS）contents，surface hydrophobicity（H0），protein solubility（PS）and emulsifying activities were evaluated.With increasing of the extent of acetylation，exposed SH content was increased，total free SH content was decreased，SS content was increased，H0was decreased first，and then increased.PS emulsifying activity index（EAI）and emulsion stability index（ESI）of rice residue proteins were improved at pH5～10 by acetylation，but PS and EAI was decreased at pH2～4.The data suggested that some functional properties of rice residue proteins could be improved by acetylation.

acetylation；rice residue protein；functional property

TS201.2

A

1002-0306（2015）20-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.015

2015－01－20

任仙娥（1979-），女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品大分子結(jié)構(gòu)與功能，E-mail：renxiane@126.com。

楊鋒（1978-），男，博士，副教授，研究方向：食品加工技術(shù)與過(guò)程強(qiáng)化，E-mail：yangfeng78@126.com。