郝修震，岳曉禹，*，李長濱，辛　婷，李軍霞（.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院質(zhì)檢系，河南鄭州450046；.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，北京00083）

嗜麥芽窄食單胞菌42-2降解黃曲霉毒素B1的效果研究

郝修震1，岳曉禹1，*，李長濱1，辛婷1，李軍霞2
（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院質(zhì)檢系，河南鄭州450046；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，北京100083）

黃曲霉毒素B1（AFB1）對人類和家畜的健康危害很大。本文以嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.42-2）為研究菌株，對其進(jìn)行了急性毒理實驗，并利用該菌的上清液、發(fā)酵液和胞外蛋白粗提取液分別進(jìn)行了發(fā)霉玉米、飼料、生大黃、柏子仁和懷山藥的黃曲霉毒素B1降解實驗。結(jié)果表明：活菌制劑在2.56×1010CFU個/mL劑量以下不會引起急性毒性反應(yīng)。在菌株42-2的上清液、發(fā)酵液和胞外蛋白粗提取液的毒素降解實驗中，三者對發(fā)霉玉米中AFB1的降解率分別為：74.90%、82.60%和65.40%；對飼料中AFB1的降解率分別為：77.60%、82.50%和71.20%；對生大黃中AFB1的降解率分別為：73%、78.10%和68.40%；對柏子仁中AFB1的降解率為：76%、79.50%和70.50%；對懷山藥中AFB1的降解率分別為：65.30%、69.10%和61.10%。

嗜麥芽窄食單胞菌，黃曲霉毒素B1，毒素降解，應(yīng)用

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由Aspergillus flavus、Aspergillums nomius、Aspergillus parasiticus等多種真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）分布范圍最廣且化學(xué)性質(zhì)最穩(wěn)定，具有很強的毒性、致癌性、致突變性和致畸性，對人類和家畜的健康危害很大［1-3］。采用微生物或其分泌的代謝產(chǎn)物來對其進(jìn)行生物脫毒處理條件相對溫和，不會破壞產(chǎn)品的品質(zhì)，而且具備專一性強、轉(zhuǎn)化效率高、對環(huán)境沒有污染等優(yōu)勢，代表了生物解毒的新方向，而且有些還能增加產(chǎn)品的風(fēng)味和營養(yǎng)價值，從而備受研究者關(guān)注［4-8］。Liu等發(fā)現(xiàn)真菌假密環(huán)菌（Armillariella tabescens）的粗提液具有降解黃曲霉毒素B1的功能，并分離出一種黃曲霉毒素脫毒酶［9-10］。Teniola等從Rhodococcus erythopolis和Mycobacterium fluoranthenivorans細(xì)胞內(nèi)獲得的提取物具有黃曲霉毒素B1降解能力［11］。Zjalic等對白腐菌（Trametes versicolor）進(jìn)行了研究，認(rèn)為其具有降解黃曲霉毒素的能力［12］。Alberts等對Rhodococcus erythropolis降解毒素進(jìn)行了研究，并說明其AFB1降解能力是通過酶解作用實現(xiàn)的［8］。對Flavobacterium Aurantiacum的文獻(xiàn)報道表明，其不僅能顯著降低液體培養(yǎng)基中的黃曲霉毒素，并且沒有毒性副產(chǎn)物的生成［13-14］。利用嗜麥芽窄食單胞菌對具體實物中黃曲霉毒素進(jìn)行降解效果的研究，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚不多見。本研究以實驗室分離保存的嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.42-2）為研究菌株，對其急性毒理進(jìn)行了初步研究，同時利用Stenotrophomonas sp.42-2的上清液、發(fā)酵液和胞外蛋白粗提取液，選擇黃曲霉毒素含量較高的樣品發(fā)霉的玉米、發(fā)霉的飼料及中草藥進(jìn)行毒素降解實驗，以分析其應(yīng)用價值，為實現(xiàn)其商品化提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Stenotrophomonas sp.42-2本實驗室保存；發(fā)霉玉米、發(fā)霉飼料實驗室自制；懷山藥、生大黃、柏子仁購自中藥市場；實驗動物成熟SD種小鼠40只，雌雄各半，四周齡，體重（20±2）g，SPF級，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物實驗室提供；飼料SPF級小鼠生長發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

HSX-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海和呈儀器制造有限公司；HZQ-Q全溫振蕩器哈爾濱東聯(lián)電子設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發(fā)酵液的制備果糖1.0%、胰蛋白胨1.0%、MgCl20.05 mol/L，起始pH為7.5，裝液量為25 mL/300 mL三角瓶，種子液培養(yǎng)時間為12 h，接種量為5%，控制降解溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。

1.2.2發(fā)霉玉米及飼料的制備將購自飼料獸藥市場的玉米、飼料，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，28℃、90%相對濕度條件下培養(yǎng)10 d，備用。

1.2.3急性毒性實驗

1.2.3.1菌懸液的制備發(fā)酵液經(jīng)離心處理得到菌體沉淀，用無菌水洗滌2次，涂布平板，參考依據(jù)GB/T 4789.2《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗》進(jìn)行菌落總數(shù)測定，計算出原始菌數(shù)，依次倍比稀釋，配制成含三個梯度活菌數(shù)的活菌懸浮液。

1.2.3.2最大耐受量的測定菌懸液采用最大耐受實驗，灌胃量為0.2 mL/只。

實驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，以了解其健康狀況和正?；顒忧闆r。飼養(yǎng)室氣溫25℃，相對濕度45%。觀察其毛色光亮、行動敏捷、無異常分泌物、健康活潑的動物留作正式實驗用。取40只健康小鼠，雌雄各半。以體重為指標(biāo)隨機分成四組，每組雌雄各5只。雌雄小鼠同時進(jìn)行實驗。實驗前全體動物隔夜禁食16 h，不限制飲水。正式實驗時，按照0.2 mL/只體重經(jīng)口灌喂給予受試小鼠。密切注意觀察2 h，看是否有急性毒性發(fā)作，記錄動物中毒癥狀及死亡情況，由此可推斷樣品引起動物哪些器官異常反應(yīng)。2 h后常規(guī)飲食，連續(xù)觀察7 d，每日早晨定時觀察記錄。根據(jù)各劑量組小鼠死亡情況查表計算最大耐受量［15-16］。

1.2.4胞外蛋白粗提取液及離心上清液的制備取發(fā)酵液置于大離心管中，6000 r/min離心15 min，得到上清液和菌體沉淀。取部分上清液進(jìn)行硫酸銨沉淀，取沉淀各添加pH8.0磷酸緩沖液使沉淀溶解。溶解后將溶液裝入透析袋中，置于4℃下，用pH8.0緩沖液透析除鹽約24 h，得到胞外蛋白粗提取液，備用。

1.2.5發(fā)霉玉米中黃曲霉毒素降解實驗

1.2.5.1發(fā)霉玉米毒素降解培養(yǎng)取發(fā)霉玉米樣品進(jìn)行粉碎，之后過20目篩，稱取80.0 g，取四個250 mL具塞錐形瓶，每個瓶中加20.0 g的玉米樣品，然后分別加入50 mL的上清液、胞外蛋白粗提取液以及發(fā)酵液，并以50 mL去離子水作為陰性對照，混合均勻，37℃降解72 h。每個處理做3個重復(fù)。

1.2.5.2玉米樣品中黃曲霉毒素B1的測定將玉米樣品液體置于80℃的烘箱中烘干，準(zhǔn)確加入50.0 mL甲醇-水（80∶20）溶液和15.0 mL石油醚（沸程60～90℃），蓋塞后150 r/min振蕩30 min。用快速定性濾紙過濾于125 mL分液漏斗中，待分層后，放下下層甲醇-水溶液于50 mL燒杯內(nèi)，從中取10.0 mL（相當(dāng)于4.0 g樣品）于蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。用20%（20+80）甲醇-PBS2.0 mL分三次（0.8、0.7、0.5 mL）溶解并徹底沖洗蒸發(fā)皿中凝結(jié)物，移至小離心管加蓋振蕩后靜置待測。

1.2.5.3黃曲霉毒素降解率的計算黃曲霉毒素降解率AFB1（%）=（降解前樣品中黃曲霉毒素含量-降解后樣品中毒素剩余量）/降解前樣品中黃曲霉毒素含量×100

降解前樣品中黃曲霉毒素含量單位、降解后樣品中毒素剩余量單位均為μg/kg。

發(fā)霉飼料中黃曲霉毒素降解率、中草藥中黃曲霉毒素降解率計算方法同上。

1.2.6發(fā)霉飼料中黃曲霉毒素降解實驗

1.2.6.1發(fā)霉飼料毒素降解培養(yǎng)結(jié)合GB/T 5009.22法進(jìn)行毒素的提取。取發(fā)霉飼料樣品進(jìn)行充分混勻，過20目篩，稱取20.0 g，取四個250 mL具塞錐形瓶，每個瓶中加5.0 g的飼料樣品，然后分別加入15 mL的上清液、胞外蛋白粗提取液以及發(fā)酵液，并以15 mL去離子水作為空白對照，混合均勻，37℃降解72 h。每個處理做3個重復(fù)。

1.2.6.2飼料樣品中黃曲霉毒素B1的測定結(jié)合GB/T 17480法進(jìn)行毒素的提取。首先將樣品液體置于80℃的烘箱中烘干，將處理好的樣品，加甲醇水溶液（1∶1）25 mL，加塞振蕩10 min，過濾于50 mL磨口試管中，棄掉1/4初濾液，再收集濾液，該濾液為待測的樣品提取液。

1.2.7霉變中草藥中黃曲霉毒素降解實驗

1.2.7.1目的中草藥的篩選從實驗室保存的中草藥中篩選出黃曲霉毒素含量較高的中草藥。具體操作是，將中草藥置于PDA培養(yǎng)基中，在30℃條件下培養(yǎng)一周，從中選出長有霉菌的中草藥。取霉變中草藥樣品進(jìn)行粉碎成粉末狀，充分混勻，過20目篩。取所選藥材粉末各80.0 g，每種取四個250 mL具塞錐形瓶，每個瓶中加20.0 g的中草藥樣品，然后分別加入50 mL的上清液、胞外蛋白粗提取液以及發(fā)酵液，并以50 mL去離子水作為空白對照，混合均勻，37℃降解72 h。每個處理做3個重復(fù)。

1.2.7.2中草藥樣品中黃曲霉毒素B1的測定首先將樣品液體置于80℃的烘箱中烘干，加甲醇水溶液（45∶55）100 mL，再加正己烷30 mL，振搖，過濾，取下層20 mL于分液漏斗中，加氯仿20 mL，振搖后靜置分層，放出氯仿層，立即經(jīng)盛有10 g氯仿濕潤過的無水硫酸銨的定量快速濾紙過濾于蒸發(fā)皿中，65℃水浴蒸干，用20%（20+80）甲醇-PBS 2.0 mL分三次（0.8、0.7、0.5 mL）溶解并徹底沖洗蒸發(fā)皿中凝結(jié)物，移至小離心管加蓋振蕩后靜置待測。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)均為3次的平均值，用SAS 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1活菌計數(shù)結(jié)果

按照要求，經(jīng)過菌落總數(shù)測定后，得到原始菌數(shù)為：2.56×1010CFU/mL。

2.2灌胃結(jié)果及最大耐受量的測定

灌胃結(jié)果觀察：灌胃后2 h觀察，小鼠均反應(yīng)正常，無異?，F(xiàn)象。連續(xù)觀察7 d，無死亡現(xiàn)象，均正常存活，存活7 d的小鼠解剖，無異常。結(jié)果見表1。

表1　菌懸液的最大耐受量Table 1　The maximum tolerance of the cells solution

小鼠對菌懸液的最大耐受量為細(xì)胞數(shù)大于2.56× 1010CFU/mL，考察成人服用益生菌活菌制劑的實際用量為每日2 g，以及FAO/WHO頒布實施的《食品益生菌評價指南》，目前商品化生產(chǎn)的活菌制劑的活細(xì)胞數(shù)大約為108個/mL，因此2.56×108CFU/mL是安全無毒的。在以后的研究中可以進(jìn)行后續(xù)的遺傳毒性實驗、亞慢性毒性實驗和慢性毒性實驗，以確保其應(yīng)用安全性。

2.3發(fā)霉玉米中黃曲霉毒素降解實驗

由圖1和表2可知，發(fā)酵液對發(fā)霉玉米中AFB1的降解作用最強，高達(dá)82.6%，其次為上清液，胞外蛋白粗提液的降解效果最差。可以推斷出起主要作用的是降解黃曲霉毒素活性蛋白，但是在降解初期，可能由于菌體對毒素具有較強的吸附作用，此時解吸附作用不明顯。分析胞外蛋白粗提液的降解效果差的原因，可能在毒素提取的過程中由于蛋白含量比較高，會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，這對ELISA檢測試劑盒造成影響，會導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，因而測出毒素含量較前兩種要高。

圖1　不同處理對玉米中AFB1的降解效果Fig.1　The AFB1 degradation results in maize

表2　ELISA檢測玉米中AFB1Table 2　The results of AFB1 in maize by ELISA method

2.4發(fā)霉飼料中黃曲霉毒素降解實驗

圖2　不同處理對飼料中AFB1的降解效果Fig.2　The AFB1 degradation results in feed

表3　ELISA檢測飼料中AFB1含量Table 3　The results of AFB1 content in feed by ELISA method

由圖2和表3可知，發(fā)酵液對發(fā)霉飼料中AFB1的降解作用最強，高達(dá)82.5%，其次為上清液，胞外蛋白粗提液的降解效果最差。這一趨勢和降解玉米中的黃曲霉毒素基本一致。并且在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)加有三種不同溶液的飼料里面沒有霉菌的生長，這可能是由于Stenotrophomnas sp.的活性代謝產(chǎn)物能有效抑制霉菌的生長，以后的實驗過程中可以加深活性產(chǎn)物對霉菌生長機理的研究。

2.5霉變中草藥中黃曲霉毒素降解實驗

從實驗室保存的中草藥中選出三種長有霉菌的中草藥，分別為生大黃、柏子仁和懷山藥。然后分別用上清液、胞外蛋白粗提取液以及發(fā)酵液對其進(jìn)行解毒，實驗結(jié)果見表4～表6和圖3。

表4　ELISA檢測生大黃中AFB1的結(jié)果Table 4　The results of AFB1 in rhubarb by ELISA method

表5　ELISA檢測柏子仁中AFB1的結(jié)果Table 5　The results of AFB1 in Seman Biotae by ELISA method

表6　ELISA檢測懷山藥中AFB1的結(jié)果Table 6　The results of AFB1 in yam by ELISA method

圖3　不同處理對不同中草藥中AFB1的降解效果Fig.3　The AFB1 degradation results in different herbal medicines

從結(jié)果可以看出，上清液、發(fā)酵液和胞外蛋白粗提取液對生大黃中AFB1的降解率分別為：73%、78.10%和68.40%；對柏子仁中AFB1的降解率為：76%、79.50%和70.50%；對懷山藥中AFB1的降解率分別為：65.30%、69.10%和61.10%。從中可知，發(fā)酵液降解三種中草藥中的AFB1能力最強，其次是上清液，最差的是胞外蛋白粗提取液。中草藥多為植物的根、莖、葉、花、果實或全草類，含有適宜霉菌生長的成分，如糖、淀粉、蛋白質(zhì)及其他營養(yǎng)物質(zhì)，在采集的過程中，常因不能及時處理，或在貯藏過程中受潮等因素而長霉，從而產(chǎn)生AFB1。采用生物活性蛋白制劑來進(jìn)行中草藥的解毒可以達(dá)到不破壞中草藥成分的目的。對毒素的降解，某些微生物可以吸附黃曲霉毒素，形成菌體黃曲霉毒素復(fù)合體，從而降低毒素的危害［17-18］。自然界中生物產(chǎn)生的某些酶或活性蛋白也具有分解毒素分子的功能性基團，可以把霉菌毒素轉(zhuǎn)化為無毒化合物［9-11］。本研究結(jié)果初步表明，Stenotrophomonas sp. 42-2菌株分泌的胞外蛋白活性物質(zhì)具有降解黃曲霉毒素的功能，與有關(guān)報道一致。Alberts等對紅串紅球菌降解AFB1的機理進(jìn)行研究，認(rèn)為其分泌的胞外酶對黃曲霉毒素產(chǎn)生生物降解作用［8］。Teniola等從污染的土壤中分離得到紅串紅球菌，其分泌的胞外酶具有較高的降解AFB1的能力［11］。Hormisch等從煤田附近污染的土壤樣品中分離到一株能夠AFB1的分支桿菌，進(jìn)一步實驗證明其對黃曲霉毒素的降解是生物酶解作用［19］。

3　結(jié)論

實驗表明活菌制劑在2.56×1010CFU/mL劑量以下不會引起急性毒性反應(yīng)。

使用Stenotrophomonas sp.42-2的上清液、發(fā)酵液和胞外蛋白粗提取液分別進(jìn)行了發(fā)霉玉米、飼料和3種中草藥的降解實驗。結(jié)果表明，對發(fā)霉玉米中AFB1的降解率分別為74.90%、82.60%和65.40%；對飼料中AFB1的降解率分別為77.60%、82.50%和71.20%；對生大黃中AFB1的降解率分別為73%、78.10%和68.40%；對柏子仁中AFB1的降解率為76%、79.50%和70.50%；對懷山藥中AFB1的降解率分別為65.30%、69.10%和61.10%。對黃曲霉毒素降解起到了較好的效果，為進(jìn)一步開展應(yīng)用研究提供了有益探索。

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Study on the degradation of aflatoxin B1 by Stenotrophomonas sp.42-2

HAO Xiu-zhen1，YUE Xiao-yu1，*，LI Chang-bin1，XIN Ting1，LI Jun-xia2
（1.Department of Quality Detection and Management，Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450046，China；2.College of Food，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Aflatoxin B1（AFB1）does great harm to human and animal health.The test of the acute toxicity of the strain had been done.The degradation tests of the AFB1 in mould maize，feed，rhubarb，semen boitae and yam had been implemented by using the strains’culture supernatant，the fermentation broth and the extracellular enzyme extract respectively.The results showed that the microbe cells didn’t cause the reaction of the acute toxic if the biomass was lower than 2.56×1010CFU/mL.The results of the degradation test of the AFB1 were as follows.In maize，the degradation rates were 74.90%，82.60%and 65.40%respectively.In feed the degradation rates were 77.60%，82.50%and 71.20%respectively.In rhubarb the degradation rates were 73%，78.10%and 68.40%respectively.In semen boitae the degradation rates were 76%，79.50%and 70.50%respectively.In yam the degradation rates were 65.30%，69.10%and 61.10%respectively.

Stenotrophomonas sp.；aflatoxin B1；toxin degradation；application

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.010

2015－02－02

郝修震（1967-），男，副教授，研究方向：食品安全，E-mail：hxz3098@163.com。

岳曉禹（1974-），男，博士研究生，副教授，研究方向：食品安全，E-mail：yuerain@163.com。

國家自然基金項目（U1404332）；鄭州市科研攻關(guān)項目（131PPTGG422-1）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃；?？萍紕?chuàng)新團隊項目（HUAHE2015015）。