黎志深，王志來，黃素娟，賈源賓，周長林*

(1.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009;2.南京曜動節(jié)能環(huán)保科技有限公司，江蘇南京210046)

當(dāng)前農(nóng)業(yè)化肥的大量使用和工業(yè)污水的大量排放，導(dǎo)致我國水體富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重，其中尤其以高濃度的氮、磷、硫化物引起的水污染最為嚴(yán)重。高濃度的氨氮和硝態(tài)氮會對許多水生動物有直接的毒害作用，使其免疫力下降，更會導(dǎo)致大量水產(chǎn)病害的發(fā)生，不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

在養(yǎng)殖水體中大量死藻、殘餌以及養(yǎng)殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有機(jī)物含量，從而增加了硫化物的含量［1］。作為重要污染物之一的硫化物，同時也是監(jiān)測養(yǎng)殖水體的重要化學(xué)指標(biāo)，對魚蝦類的生長繁殖危害較為嚴(yán)重，有很大的毒性。硫化物通過與養(yǎng)殖生物血液中的血紅蛋白結(jié)合從而產(chǎn)生硫血紅蛋白，使機(jī)體中血液的攜氧能力下降。另外，硫化物對養(yǎng)殖生物的鰓組織具有很強(qiáng)的刺激和腐蝕作用，可使組織產(chǎn)生凝血性壞死，引起生物呼吸困難，血液、腎中硫代硫酸鹽水平增加，當(dāng)硫化物含量于2 mg/L可導(dǎo)致養(yǎng)殖生物死亡［2］。因此，有效解決水體富營養(yǎng)化這個難題已成為當(dāng)今亟需解決的環(huán)境問題之一，也是當(dāng)今水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。

生物脫氮除硫是微污染水治理和水生態(tài)調(diào)控的重要技術(shù)，一般需要反硝化細(xì)菌和硫細(xì)菌2種菌種同時參與，分別以脫氮、除硫2個過程完成［3］。生物脫氮主要在厭氧條件下以異養(yǎng)型反硝化細(xì)菌，以有機(jī)物為碳源和電子供體，以為電子受體，將轉(zhuǎn)化為N2，從而從水體中除去［4］。A/O或A2/O工藝是生物脫氮最常用的方法，其操作工藝相對復(fù)雜，而且經(jīng)常需要額外添加有機(jī)物以便進(jìn)行異養(yǎng)反硝化，這大大提高了工程運(yùn)行成本。硫化物的脫除一般是在通氣條件下利用硫細(xì)菌的硫化作用將其氧化除去。據(jù)報道，近年來發(fā)展起來的生物氧化脫硫工藝多采用無色硫細(xì)菌或光合硫細(xì)菌去除硫化物，因其負(fù)荷低，單質(zhì)硫黏附于細(xì)胞表面難以分離等問題而限制其實(shí)際工程應(yīng)用，因此大多數(shù)研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室的小試階段而難以實(shí)際應(yīng)用［5］。

研究表明，一些微生物能以硝酸鹽為電子受體將硫化物氧化成單質(zhì)硫［6］和硫酸鹽［7］。筆者從自然環(huán)境中分離篩選出1株同時具有脫氮除硫能力的菌株，并對其活性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來源。從污水處理廠旁水溝獲得淤泥。

1.1.2 培養(yǎng)基。①基本培養(yǎng)基:Na2S2O3·5H2O 5 g、KNO32 g、NaHCO31 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.05 g、NH4Cl 0.5 g，用蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至 7.0，121 ℃滅菌30 min備用。②富集培養(yǎng)基:2X基本培養(yǎng)基組分。③平板、斜面培養(yǎng)基:在基本培養(yǎng)基中加入2% 瓊脂。④生理生化培養(yǎng)基:配制方法參照文獻(xiàn)［8］中方法。

1.1.3 儀器。FE-20pH計、TD16-W離心機(jī)、KH-500SP型雙頻數(shù)控超聲波清洗器、721型可見分光光度計、BL600電子天平、厭氧培養(yǎng)盒、New Brunswick Scientific搖床、SFC-182AQLED-MS光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集分離。將從污水廠旁水溝取來的泥土5 g加入到含有100 ml富集培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中，于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d。采用倍比稀釋法將菌液稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和 10-7梯度的菌懸液，取稀釋度為10-5、10-6、10-7菌懸液各0.2 ml均勻涂布于含10 ml基本培養(yǎng)基的平板上。將平板用封口膜封好后倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取不同形態(tài)的單菌落采用劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化，直到得到單菌落的純培養(yǎng)物。純化后的菌株保存于含有基本培養(yǎng)基的斜面上。

1.2.2 菌株脫氮除硫能力的檢測。挑取各菌株的單菌落接種到含有5 ml篩選培養(yǎng)基的試管中，將試管置于厭氧培養(yǎng)盒中30℃下培養(yǎng)。測定其5 d后硝態(tài)氮(NO3--N)和硫酸根(SO4

2-)濃度的變化，篩選出脫氮除硫能力強(qiáng)的菌株。硝態(tài)氮含量的檢測采用水楊酸光度法，硫酸根濃度的檢測采用鉻酸鋇比色法［9］。

1.2.3 菌株形態(tài)及生理生化檢測。觀察平板培養(yǎng)基中篩選菌株的菌落特征，同時進(jìn)行革蘭染色后在顯微鏡中觀察。將篩選出的菌株在半固體穿刺培養(yǎng)基中進(jìn)行穿刺培養(yǎng)，檢測其動力活性。制備篩選菌株的菌懸液，分別接種到葡萄糖培養(yǎng)基、麥芽糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基和硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基等進(jìn)行生理生化檢測。

1.2.4 16S rDNA測序。將純化好的菌株斜面送交北京金唯智公司進(jìn)行測序。16S rDNA檢測的通用引物序列如下:27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇;1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。

1.3 溫度、pH和金屬離子對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。

1.3.1 溫度對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。將篩選菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)后接種10% 到含有5 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管中置于厭氧培養(yǎng)盒中，分別于20、25、30、35和40℃中培養(yǎng)，5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根濃度的變化。

1.3.2 初始pH對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。將篩選菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)后接種10%到含有5 ml pH分別為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和9.0 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管中并置于厭氧培養(yǎng)盒中培養(yǎng)，5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根濃度的變化。

1.3.3 金屬離子對篩選菌株脫氮除硫能力的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2.5 mmol/L的CuSO4和CoCl2·6H2O，將篩選菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)后接種10%到這2個培養(yǎng)基中培養(yǎng)，5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根濃度的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的脫氮除硫能力 從淤泥的富集物中分離出50個菌株，經(jīng)初篩挑選出10株進(jìn)行硝態(tài)氮和硫酸根濃度的檢測試驗(yàn)。培養(yǎng)5 d后檢測其硝態(tài)氮和硫酸根的濃度(圖1)，與培養(yǎng)前對比，得出硝態(tài)氮降解率和硫酸根生成率(表1)。在初始硝態(tài)氮濃度為270.8 mg/L，硫酸根濃度為402.1 mg/L的條件下經(jīng)過5 d培養(yǎng)后，與對照相比所有菌株硝態(tài)氮濃度都有一定程度下降，最低降解率為15.2%，硝態(tài)氮濃度為229.5 mg/L;最高降解率為93.9%，硝態(tài)氮濃度下降到16.6 mg/L。硫酸根濃度與對照相比也有一定程度上升，最低生成率為12.7%，硝態(tài)氮濃度上升為453.1 mg/L，最高生成率達(dá)到74.9%，此時硝態(tài)氮濃度為703.2 mg/L。結(jié)果表明，所有篩選出的菌株都具有一定程度的脫氮或除硫能力，但兩者效果不一樣。JD4的硝態(tài)氮降解率和硫酸根生成率都超過70%，因此選擇JD4作為后續(xù)的試驗(yàn)對象。

表1 培養(yǎng)5 d后菌株硝態(tài)氮降解率和硫酸根生成率的變化

表2 菌株JD4的生理生化鑒定結(jié)果

2.2 菌株形態(tài)及生理生化檢測結(jié)果 從圖2可以看出，JD4在平板中培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)菌落呈針尖狀，透明，扁平濕潤，菌落直徑約為1.0～1.5 mm。經(jīng)革蘭染色后用光學(xué)顯微鏡觀察，JD4的細(xì)胞呈桿狀，單個或短鏈狀排列，有鞭毛，無芽孢，革蘭陰性(表2)。

2.3 16S rDNA測序結(jié)果 將篩選到的菌株委托北京金唯智公司進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增及序列測定，得到全長為1 421 bp堿基對核苷酸序列。將測得的序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行比對，對其進(jìn)行了同源分類鑒定，發(fā)現(xiàn)其與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)的多個菌株序列的相似性都達(dá)到99%以上。將其與部分參考菌株進(jìn)行了DNA序列的對比，并通過Mega 6.0軟件做出了菌株JD4的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

2.4 溫度對篩選菌株脫氮除硫能力的影響 從圖4可以看出，溫度范圍在20～40℃內(nèi)JD4在30℃下硝態(tài)氮降解率為91.2%，硫酸根生成率為83.9%，均為最大值，表明30℃為JD4脫氮除硫的最適溫度。

2.5 初始pH對篩選菌株脫氮除硫能力的影響 從圖5可以看出，硝態(tài)氮降解率和硫酸根的生成率隨pH的增大而增大，在pH 7.0時硝態(tài)氮降解率達(dá)到最大值(92.2%)，而硫酸根生成率為61.7%;在pH 7.5時，硝態(tài)氮降解率為84.0%，硫酸根生成率達(dá)到最大值(66.8%)。這表明JD4在pH為7.0～7.5時脫氮除硫效果最好。

2.6 金屬離子對篩選菌株脫氮除硫能力的影響 在實(shí)際的養(yǎng)殖水體中很可能含有濃度不一的金屬離子，其中比較常見的是Cu2+和Co2+。從圖6～7可以看出，Cu2+和Co2+的存在能明顯抑制JD4的脫氮除硫能力。因此，該菌株不適合用于高濃度金屬離子污水的治理。

3 小結(jié)

筆者通過使用選擇性培養(yǎng)基從污水淤泥中分離到具有同步脫氮除硫作用的菌株10株，各菌株脫氮除硫能力不同。其中硝態(tài)氮最高降解率為93.9%，硫酸根最高生成率達(dá)到74.9%。根據(jù)菌落形態(tài)特征、生理生化鑒定及16SrDNA序列測序，脫氮除硫效果最好的JD4被認(rèn)為屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)。

該試驗(yàn)結(jié)果表明JD4脫氮除硫的最適溫度為30℃，最適pH為7.0～7.5，不適用于含有高濃度金屬離子的養(yǎng)殖水處理。

與化學(xué)物理法處理養(yǎng)殖水和污水相比，利用微生物不僅省時省力而且不再對環(huán)境進(jìn)行二次污染。該研究篩選出的假單胞菌JD4具有良好的脫氮除硫能力，可以碳酸氫鹽為碳源、硫化物為能源和硝態(tài)氮為氮源生長，對營養(yǎng)要求不高，其在厭氧條件下能以S2-為電子供體使硫化物氧化為S或、以 NO3-為電子受體使硝酸鹽還原為N2、S 和少量的SO42-都是在自然水生態(tài)中可接受的無毒物質(zhì)，因此該菌株在水處理工程、微污染水的脫氮除硫和在自然水體的生態(tài)調(diào)控中具有應(yīng)用價值［11］。該菌在自養(yǎng)條件下即可發(fā)揮作用，后續(xù)可以通過馴化獲得能在低溫進(jìn)行脫氮除硫的菌株，更有利于實(shí)際應(yīng)用。同時，假單胞菌可與脫氮硫桿菌［12］、芽孢桿菌［13］等具有凈水能力的菌株制成微生物混合制劑，能更全面有效治理各種污染水體。

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