鄢興華等

摘 要 建立了一種基于微流控滑移芯片的反應微陣列體系，并應用于雙濃度梯度研究。在此反應微陣列芯片中，兩種試劑分別通過芯片進樣形成多級濃度梯度，進一步在正交方向上形成雙濃度梯度的微反應陣列，經過滑動、接觸和混合，簡便實現(xiàn)多路反應。采用不同色素和熒光染料對系統(tǒng)進行了表征，確認了方法的可靠性，在此基礎上， 考察了β-半乳糖苷酶（β-gal）的反應條件。將45 nmol/L β-gal和45 μmol/L底物熒光素二半乳糖苷（FDG）分別注入芯片上下層，在芯片通道中各自形成濃度梯度，滑移后進行不同酶濃度和不同底物濃度的反應測定。結果表明，隨著底物濃度的提高，反應產物逐漸增多；一定底物濃度下，產物隨酶濃度升高而逐漸增多，但很快到達平臺期。芯片上酶與底物的濃度對反應的影響與芯片外基本一致。此芯片具有結構簡單、操作簡便和消耗低等特點，適用于多因素和多水平的復雜反應分析。

關鍵詞 微流控； 滑移芯片； 雙濃度梯度； β-半乳糖苷酶

1 引 言

生命科學的飛速發(fā)展對高通量分析技術提出了更迫切的要求。陣列技術以其規(guī)?；行蚣傻牟僮鞣绞匠蔀楫斍案咄考夹g代表。微流控芯片是近年發(fā)展起來的新概念分析技術，以其微型化、集成化和自動化等優(yōu)點備受矚目。將微流控芯片技術與陣列技術結合，即陣列微流控芯片或微流控陣列芯片已成為芯片分析的最重要方向之一，廣泛應用于生物醫(yī)學分析。陣列式的微反應器越來越被研究人員重視，各種陣列形成方式得到廣泛嘗試與驗證，如液滴陣列[1，2]、微孔陣列[3～5]、電極陣列[6]、磁珠陣列[7]等，并實際應用于基因組學、蛋白質組學，甚至細胞、組織等分析，如RT PCR[8～10]、DNA甲基化分析[11]、單分子酶的測定[12]、細胞培養(yǎng)[13～15]、胚胎研究[16，17]、單細胞研究[18～20]、病毒檢測與基因分型[21，22]等。

滑移芯片是Ismagilov研究組提出的一種新微反應陣列平臺。這種組合芯片通過兩塊芯片之間的相對滑動實現(xiàn)指定通道和孔的接通與斷開，從而實現(xiàn)樣品和反應物的進樣、混合、洗脫及反應等功能。該研究組采用滑移芯片實現(xiàn)了單種樣品和多種試劑的多路同時反應[23，24]，在此基礎上進一步實現(xiàn)了蛋白質結晶條件篩選[23，25]、PCR[26，27]、免疫測定[28]、細菌培養(yǎng)[29]等高通量分析。

濃度梯度是實現(xiàn)多路高通量反應的方式之一，可以減少多濃度試劑需求實驗中的樣品準備時間，并且更加精確和易于調整。微流控芯片可以形成精確的濃度梯度，且通過改變網(wǎng)絡通道的構型設計及初始液流的濃度和組合順序，可獲得一系列復雜的濃度梯度。在芯片上形成雙濃度梯度的難點在于每種濃度梯度的形成需要一個獨立不受干擾的區(qū)域或平面，而兩種試劑的混合可能會造成流體的互相干擾和通道的互相影響。Hung等[30]在垂直交叉的芯片通道交叉處用閥的開關控制流體方向，可使兩個方向的試劑分別形成濃度梯度，但同時形成兩種濃度梯度仍有困難。滑移芯片為解決同一平面的兩種濃度梯度互相干擾的情況提供了全新思路，即通過兩塊不同平面的芯片分別形成濃度梯度，再通過芯片滑移操作將兩種濃度梯度的試劑進行接觸混合反應。兩種濃度梯度同時形成， 且互不影響，形成后也能使不同濃度的兩種試劑以正交的形式交叉反應。

本研究發(fā)展了一種基于滑移芯片的雙濃度梯度反應陣列平臺，可通過簡單的樣品注入，同時形成兩種試劑的多水平的濃度梯度，并將其以正交的方式相互接觸與混合，形成正交濃度的微反應陣列，從而簡單地同時實現(xiàn)多組反應。在色素與熒光素對該平臺進行表征的基礎上，成功實現(xiàn)了β-半乳糖苷酶與底物反應優(yōu)化條件的測定。此系統(tǒng)有結構簡單、操作方便、消耗小等特點，廣泛適用于多因素、多指標（水平）的生物及化學反應研究與分析。

2 實驗部分

2.1 材料與試劑

熒光素、NaCl、EDTA、Tris等（上海國藥集團化學試劑有限公司）；β-半乳糖苷酶及底物FDG（Fluorescein di-β-D-galactopyranoside）購自北京博奧森生物有限公司；FC-40（3M公司）。除特殊說明外，所有試劑均為分析純，實驗用水均來自Direct-Q system （Millipore， Bedford， MA， USA）所產的超純水，在使用前所有溶液均用0.45 μm濾頭先行過濾。

2.2 芯片設計與制作

本實驗的滑移芯片由兩塊相同的PDMS/玻璃芯片組成，并通過PMMA夾子使兩塊芯片的玻璃面相互接觸與固定（圖1c）。每塊PDMS/玻璃芯片都包括PDMS上的通道部分和玻璃上鑿空的孔陣列，其中PDMS通道包括濃度梯度形成部分及多路平行的非連續(xù)通道部分，玻璃基底上包括用作反應孔的大孔陣列和用于連接另一塊芯片反應孔的小孔陣列；將玻璃和對應的PDMS芯片鍵合后，非連續(xù)通道的末端與小孔一一對應，再將芯片底面進行疏水處理。PMMA夾子包括兩片有螺紋孔及滑道的PMMA板，通過四角的螺絲可以將兩塊芯片固定和壓緊，PMMA板上的斜向滑道可以準確的限定芯片滑動的方向和距離。芯片通道高50 μm，寬300 μm，連接孔與反應孔直徑分別為1.0 和1.5 mm。

2.3 芯片實驗操作

將兩塊疏水處理后的芯片玻璃底面用全氟化合物FC-40浸潤，再將兩底面對準，使得每塊芯片上的大孔均勻連接另一塊芯片上的小孔。將對準后的芯片用PMMA夾子夾緊，兩片PMMA板正好與兩塊芯片的PDMS面相接觸。

用PMMA夾子將兩塊芯片組裝到一起后（圖1c），芯片上的大孔陣列可以將另一塊芯片上的小孔陣列連接起來，進而將芯片上的非連續(xù)通道接通，可以實現(xiàn)兩塊芯片的同時進樣，并同時產生濃度梯度（如圖1a所示）。通過微泵將樣品和反應物分別與緩沖液一起注入兩塊芯片中，控制流速，即可在兩塊芯片上分別形成樣品和反應物的濃度梯度。由于兩種濃度梯度是在不同的芯片平面上產生的，因此互不干擾，并且使得每塊芯片上的大孔即反應孔陣列都充滿了另一塊芯片上形成的濃度梯度溶液，為下一步混合做好準備。

進樣完成后，沿著PMMMA夾子上層四角預留的滑道進行滑動，由于PMMA與PDMS之間的摩擦力遠大于中間有FC-40潤滑的玻璃與玻璃之間的摩擦力，因此上層PDMS芯片會隨著PMMA板一起，沿著滑道移動，從而斷開兩塊芯片的通道，同時使得分別充滿兩類濃度梯度溶液的反應孔陣列一一對應，樣品和反應物進行混合并反應（圖1b）。

2.4 芯片表征與β-半乳糖苷酶反應

分別用色素和熒光素對此芯片形成雙濃度梯度的效果進行評估。評估分別采用肉眼可見的色素溶液和肉眼不可見的熒光素溶液進行定性和定量分析。首先測試了單層芯片的濃度梯度形成效果，用黃色和藍色色素溶液分別注入單塊芯片的兩個入口，觀察4條通道的色素顏色以判斷混合情況；對組合好的芯片，上層芯片兩個入口分別注入綠色色素溶液和水，下層芯片兩個入口分別注入紅色色素溶液和水。完成了色素對芯片的表征后，同樣用熒光素溶液進行了實驗。芯片入口分別注入1.0×104 mol/L 的熒光素溶液和水，待形成穩(wěn)定濃度梯度后進行熒光強度的測定。

此芯片還用于β-半乳糖苷酶與底物FDG的反應測定。在確定了合適的反應時間和反應濃度范圍后，上層芯片注入45 nmol/L β-Gal溶液和水，下層芯片注入45 μmol/L FDG溶液和水，待形成穩(wěn)定濃度梯度后，將芯片進行滑移，接觸反應1 h后，對反應孔的反應產物進行光強測定。

3 結果與討論

3.1 有限元模擬

采用Fluent軟件對芯片通道進行了有限元模擬，以驗證此設計是否能形成符合要求的濃度梯度。以水為對象，采用與實際實驗中相同的通道尺寸和立體結構，模擬流體在上下層通道間的流動和混合情況。流體流速分別設置為0.1， 0.5， 1.0， 5.0和10.0 μL/min，模擬濃度場分布如圖2所示（流速為0.5 μL/min）。結果表明，流體在由不同平面的通道和孔連接而成的芯片通道中能夠很好地擴散混合，此通道設計理論上能很好地形成穩(wěn)定連續(xù)的濃度梯度。

3.2 芯片表征

芯片組裝完成后，首先對單層芯片的濃度梯度形成情況進行了實驗，往上層芯片的兩個入口分別注入黃色色素溶液和藍色色素溶液，黃色和藍色色素混合會形成綠色。結果表明，單層芯片能較好的形成符合預期的濃度梯度（如圖3a）。此后，用色素對雙層芯片進行了驗證。上層芯片分別注入綠色色素溶液和水溶液，同時，下層芯片分別注入紅色色素溶液和水溶液，經過一段時間后，兩層芯片分別獨立的形成了基本符合要求的濃度梯度（如圖3b所示）。

在用色素溶液對芯片濃度梯度進行定性表征后，采用熒光素溶液對芯片的濃度梯度情況進行了定量表征。芯片中分別注入1.0×104 mol/L熒光素溶液和水，待穩(wěn)定后，在熒光場下用顯微鏡觀察和測量，并用Image Pro Plus和Origin Pro進行數(shù)據(jù)處理，繪制標準曲線圖和3D柱形圖（圖3c和3d）。結果表明，此芯片平臺能形成符合預期的濃度梯度。

3.3 β-半乳糖苷酶反應

采用此芯片進一步進行了β-半乳糖苷酶和底物FDG的反應測定。首先在多孔板上探索了酶反應時間對反應產物的影響。實驗中，選取了不同濃度的β-半乳糖苷酶（15， 30和45 nmol/L）和不同濃度的底物FDG（15， 30和45 μmol/L），分別進行混合后，相隔不同時間（0， 0.25， 0.5， 0.75， 1.0， 1.5和2.0 h）后測量反應產物光強（圖4）。隨著反應時間延長，產物光強逐漸上升，約1 h后，產物光強到達平臺期。因此，選擇1 h作為反應時間，既能保證反應充分進行，也給測量預留了足夠的時間，不會出現(xiàn)光強明顯衰減的情況。

確定反應時間后，在多孔板和芯片上分別進行了酶反應的測定。根據(jù)多次篩選，確定了合適的酶濃度（0， 15， 30和45 nmol/L）和底物濃度（0， 15， 30 和45 μmol/L）。在多孔板上，分別加入4個濃度的β-Gal和4個濃度的FDG，形成不同濃度組合，反應1 h后測量光強。在芯片中，上層芯片注入45 nmol/L β-Gal和水，下層芯片注入45 μmol/L FDG和水，待形成穩(wěn)定濃度梯度后，滑動芯片，使反應孔接觸，反應1 h后測量光強。用Image Pro Plus和Origin Pro對測量數(shù)據(jù)進行處理，并繪制了2D和3D柱形圖（圖5）。

由圖5可知，隨著底物濃度增大，反應產物逐漸增多；隨著酶濃度增大，產物逐漸增多，但很快到達平臺期（當酶濃度為30和45 nmol/L時，產物光強基本一致）。芯片上的酶反應與多孔板上的反應趨勢基本一致，酶和底物濃度對反應的影響也基本一致，這表明此芯片平臺對β-半乳糖苷酶反應條件的測定是可靠的。

4 結 論

濃度梯度技術是科學研究中優(yōu)化實驗條件的重要手段。在微流控芯片上研究濃度梯度具有自動化、微型化、高通量的優(yōu)點，因而在藥物篩選、免疫分析、細胞刺激等方面得到了廣泛應用。但多數(shù)研究都限于單一條件的濃度梯度形成，而不能同時形成兩個或多個條件的濃度梯度，無法應對多因素復雜反應的需要。本研究建立了一種基于滑移芯片的反應陣列平臺，并應用于雙濃度梯度研究。此芯片系統(tǒng)包含上下兩塊相同的PDMS/玻璃芯片，兩種試劑分別通過芯片進樣，能同時各自形成不同平面上的濃度梯度，再經過兩塊芯片的滑動，兩個平面上不同類別的試劑接觸、混合并反應，從而實現(xiàn)多路不同濃度條件下的反應。用色素和熒光素對系統(tǒng)進行了表征，確認本方法的可靠性，并進一步實現(xiàn)了β-半乳糖苷酶反應條件的優(yōu)化測定。該芯片具有結構簡單、操作簡便、消耗低、速度快等特點，適用于多因素和多水平的復雜反應分析。

References

1 Shen H， Fang Q. Talanta， 2008， 77（1）： 269-272

2 Zhu Y， Zhang Y X， Liu W W， Ma Y， Fang Q， Yao B. Sci. Rep.， 2015， 5： 9551

3 Park E S， Brown A C， DiFeo M A， Barker T H， Lu H. Lab Chip， 2010， 10（5）： 571-580

4 Lindstrom S， Mori K， Ohashi T， Andersson-Svahn H. Electrophoresis， 2009， 30（24）： 4166-4171

5 Park S， Bassat D B， Yossifon G. Biomicrofluidics， 2014， 8（2）： 024117

6 Hirano Y， Yasukawa T， Sawayashiki Y， Shiku H， Mizutani F， Matsue T. Electrochemistry， 2010， 78（2）： 175-177

7 Yang X H， Zhao X， Zuo X B， Wang K M， Wen J H， Zhang H. Talanta， 2009， 77（3）： 1027-1031

8 Zhang Y X， Zhu Y， Yao B， Fang Q. Lab Chip， 2011， 11（8）： 1545-1549

9 Ramalingam N， Rui Z， Liu H B， Dai C C， Kaushik R， Ratnaharika B， Gong H Q. Sensor. Actuat. B-Chem.， 2010， 145（1）： 543-552

10 Wong W， Farr R， Joglekar M， Januszewski A， Hardikar A. J. Vis. Exp.， 2015， （98）： e52586

11 Zhang Y， Bailey V， Puleo C M， Easwaran H， Griffiths E， Herman J G， Baylin S B， Wang T H. Lab Chip， 2009， 9（8）： 1059-1064

12 Sakakihara S， Araki S， Iino R， Noji H. Lab Chip， 2010， 10（24）： 3355-3362

13 Liu M C， Tai Y C. Biomed. Microdevices， 2011， 13（1）： 191-201

14 Frimat J P， Becker M， Chiang Y Y， Marggraf U， Janasek D， Hengstler J G， Franzke J， West J. Lab Chip， 2011， 11（2）： 231-237

15 Wilson J L， Suri S， Singh A， Rivet C A， Lu H， McDevitt T C. Biomed. Microdevices， 2014， 16（1）： 79-90

16 Kang E， Choi Y Y， Jun Y， Chung B G， Lee S H. Lab Chip， 2010， 10（20）： 2651-2654

17 Chung K， Kim Y， Kanodia J S， Gong E， Shvartsman S Y， Lu H. Nat. Methods， 2011， 8（2）： 171-176

18 Li Y W， Feng X J， Du W， Li Y， Liu B F. Anal. Chem.， 2013， 85（8）： 4066-4073

19 Wang Y， Tang X L， Feng X J， Liu C， Chen P， Chen D J， Liu B F. Anal. Bioanal. Chem.， 2015， 407（4）： 1139-1148

20 Kumar P T， Vriens K， Cornaglia M， Gijs M， Kokalj T， Thevissen K， Geeraerd A， Cammue B P A， Puers R， Lammertyn J. Lab Chip， 2015， 15（8）： 1852-1860

21 Zhang H， Xu T， Li C W， Yang M S. Biosens. Bioelectron.， 2010， 25（11）： 2402-2407

22 Ahlford A， Kjeldsen B， Reimers J， Lundmark A， Romani M， Wolff A， Syvanen A C， Brivio M. Analyst， 2010， 135（9）： 2377-2385

23 Du W B， Li L， Nichols K P， Ismagilov R F. Lab Chip， 2009， 9（16）： 2286-2292

24 Li L， Du W B， Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc.， 2010， 132（1）： 106-111

25 Li L， Du W B， Ismagilov R F. J. Am. Chem. Soc.， 2010， 132（1）： 112-119

26 Shen F， Du W B， Davydova E K， Karymov M A， Pandey J， Ismagilov R F. Anal. Chem.， 2010， 82（11）： 4606-4612

27 Shen F， Du W B， Kreutz J E， Fok A， Ismagilov R F. Lab Chip， 2010， 10（20）： 2666-2672

28 Liu W S， Chen D L， Du W B， Nichols K P， Ismagilov R F. Anal. Chem.， 2010， 82（8）： 3276-3282

29 Ma L， Datta S S， Karymov M A， Pan Q C， Begolo S， Ismagilov R F. Integr. Biol.， 2014， 6（8）： 796-805

30 Hung P J， Lee P J， Sabounchi P， Lin R， Lee L P. Biotechnol. Bioeng.， 2005， 89（1）： 1-8