吳丹，劉春雷，閔偉紅，*

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

長(zhǎng)白山松子降血壓肽制備工藝優(yōu)化

吳丹1，2，劉春雷1，2，閔偉紅1，2，*

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

采用堿性蛋白酶對(duì)長(zhǎng)白山松子分離蛋白進(jìn)行酶解，以水解度和酶解物的ACE抑制率為考察指標(biāo)，考察酶解pH、酶解溫度、底物濃度、加酶量4個(gè)因素的影響，通過(guò)響應(yīng)面（Box-Benhnken）組合優(yōu)化試驗(yàn)，確定得到ACE抑制率最佳的條件為酶解pH8.9，酶解溫度55℃，加酶量7 500 U/g（以底物計(jì)），底物濃度2.5%，此時(shí)ACE抑制率為70.1%，水解度為17.5%，與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

長(zhǎng)白山松子；降血壓肽；ACE；抑制率

松子（Pinus konaiensis Sieb.et Zucc.）屬松科松屬植物，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的藥食同源物質(zhì)［1］。國(guó)內(nèi)松子主要分為兩種，東北松子和巴西松子。現(xiàn)已研究松子蛋白質(zhì)含量89%左右，含有17氨基酸，其中8種必需氨基酸滿足FAO/WHO規(guī)定的成人推薦值［2-3］。

植物蛋白酶解后釋放出活性多肽［4］，降血壓肽（Antihypertension Pepfide）又稱(chēng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽，是酶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的一類(lèi)具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的多肽物質(zhì)。一般含2～14個(gè)氨基酸。不同來(lái)源的降血壓肽，其相對(duì)分子質(zhì)量大小和氨基酸組成不完全相同［5］。ACE抑制肽最早是Ferreira在1965年從美洲茅頭短蛇毒中發(fā)現(xiàn)的，隨后又從蛇毒中獲得了多種氨基酸的抑制肽［6］。源于食品的降血壓肽是一類(lèi)能夠降低人體血壓的小分子多肽的總稱(chēng)［7］。這些肽類(lèi)食用安全性高，對(duì)血壓正常人群無(wú)降壓作用，易消化吸收，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高毛細(xì)血管通透性等作用，且無(wú)副作用，可用作降壓功能性食品或藥物基料，已成為目前研究的熱點(diǎn)［8］。

目前少見(jiàn)對(duì)長(zhǎng)白山松子降血壓肽研究的報(bào)道，本試驗(yàn)以松子分離蛋白為原料，利用酶控制水解技術(shù)，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)組合確定制備長(zhǎng)白山松子降血壓肽的最佳酶解條件，為長(zhǎng)白山松子降血壓肽的理論研究和進(jìn)一步的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1材料與儀器

1.1材料

松子分離蛋白（蛋白含量89.69%）：實(shí)驗(yàn)室自制。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（0.25UN）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）：購(gòu)于sigma公司；Alcalase 2.4L FG：Novozymes公司；磷酸二氫鈉，乙酸乙酯等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器

FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康儀器有限公司；Z36HK型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)HERMLE公司；FE20型pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；UV-1700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津；SartoriusRSA224S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1水解度（DH）測(cè)定

采用pH-stat法［9］。

1.3.2測(cè)定ACE抑制率

運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定［10-11］。

1.3.3酶解松子分離蛋白響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

采用響應(yīng)曲面法的中心組合設(shè)計(jì)，以抑制率為指標(biāo)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。依據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果確定4個(gè)因素的水平編碼如表1所示。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合建立回歸模型。

表1　因素水平表Table 1Table of factor level

2結(jié)果與分析

2.1模型建立與分析

利用Design-Expert軟件，通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合見(jiàn)表2。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2Design and results of Box-Behnken

續(xù)表2Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2Design and results of Box-Behnken

得到回歸方程為：抑制率=69.68-0.43A-0.73B+ 0.93C+9.68D-2.25AB-7.65AC-4.75AD-8.75 BC-0.35BD+5.42CD-9.04A2-13.07B2-5.01 C2-10.43D2

對(duì)抑制率方差分析結(jié)果見(jiàn)表3所示。

表3　回歸模型方差分析表Table 3Variance analysis of experimental results

所建立的二次回歸模型是極顯著的（Prob＜0.01），P值于越小，相應(yīng)參數(shù)的顯著性越明顯［12］。失擬項(xiàng)0.125 5大于0.05，差異不顯著，說(shuō)明其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小，模型與試驗(yàn)值結(jié)果擬合較好，具有代表性；同時(shí)回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.904 9，說(shuō)明90.49%可變動(dòng)性可以用該響應(yīng)面模型解釋?zhuān)梢岳迷摶貧w方程對(duì)酶解工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)［13］。根據(jù)回歸模型方程中各因素回歸系數(shù)絕對(duì)值大小，可知各因素影響抑制率的順序：底物濃度＞加酶量＞溫度＞pH。

2.2響應(yīng)面分析及優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀見(jiàn)圖1。

圖1　各因素交互作用對(duì)抑制率影響的三維曲面圖Fig.1Response surface of mutual influence on the reducing power ability

分析4個(gè)因素對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制率的影響。最大值是由橢圓輪廓圖表面上突出處預(yù)測(cè)［14］。通過(guò)Design-Expert軟件分析，得出酶解分離蛋白最佳工藝條件：pH8.9，溫度55℃，加酶量7 500 U/g，底物濃度2.5%，此條件下驗(yàn)證，得到ACE抑制率為70.1%，水解度為17.5%，與模型預(yù)測(cè)值較為吻合。采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解松子分離蛋白工藝條件比較可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3結(jié)論

本試驗(yàn)用堿性蛋白酶解長(zhǎng)白山松子分離蛋白得到降血壓酶解產(chǎn)物，對(duì)pH、溫度、加酶量、底物濃度以ACE抑制率為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并建立了回歸模型，方差分析表明擬合較好。優(yōu)化后最佳工藝參數(shù)：pH值8.9，溫度55℃，加酶量7 500 U/g，底物濃度2.5%，酶解時(shí)間3 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到ACE抑制率為70.1%，水解度為17.5%，與響應(yīng)面試驗(yàn)相符。本試驗(yàn)研究長(zhǎng)白山松子降血壓多肽，為今后研究松子多肽提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為長(zhǎng)白山松子降血壓肽功能性食品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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Preparation and Optimization of Antihypertensive Peptides from Pinus koraiensis Sieb.et Zucc Nuts in Changbai Mountain

WU Dan1，2，LIU Chun-lei1，2，MIN Wei-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

Pinus koraiensis Sieb.et Zucc protein isolate was hydrolyzed with alcalase to prepare antihypertensive peptides.Operating parameters such as pH，temperature，substrate concentration and enzyme dosage were optimized using response surface analysis based on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate.The optimum hydrolysis conditions for ACE inhibitory rate（70.1%）and degree of hydrolysis（17.5%）were found to be hydrolysis at 55℃，pH 8.9 for 3 h with an enzyme/substrate ratio of 7 500 U/g and substrate concentration of 2.5%，with the model prediction.

Changbai Mountain pine nuts；antihypertensive peptides；ACE；inhibitory activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.024

2014-06-16

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102206）

吳丹（1989—），女（蒙古），碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

閔偉紅（1971—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程、糧油科學(xué)與深加工技術(shù)研究。