劉螢吳小平蘇麗芳王文珺陳銀輝

（1.北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026；2.北京維德維康生物技術(shù)有限公司）

ELISA快速測定牛奶中阿維菌素前處理方法的建立

劉螢1吳小平2*蘇麗芳2王文珺2陳銀輝2

（1.北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026；2.北京維德維康生物技術(shù)有限公司）

改進ELISA快速測定牛奶中阿維菌素的前處理方法，以改進后處理液作為標準品基質(zhì)繪制標準曲線，IC50濃度值為1.9 μg/L，與PBS緩沖液測定值相同；對牛奶中阿維菌素的檢出限為2.0 μg/L，對牛奶樣品的加標回收率范圍為75.8%-104.8%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均未超過15.0%；以兩種前處理方法對實際樣品進行處理后檢測，改進后處理方法檢測結(jié)果更接近儀器方法檢測值且與檢測值相差不大，因此該試劑盒可滿足相關(guān)殘留檢測國家標準，能滿足我國市場和進出口食品檢測需要。

阿維菌素；前處理；試劑盒；牛奶

1 前言

阿維菌素（Avermectins，）是由鏈霉素產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，對線蟲和節(jié)肢動物有極強的驅(qū)殺作用，是目前獸醫(yī)臨床上用量最大的抗寄生蟲藥［1，2］，50%以上的抗寄生蟲藥為該類藥物。阿維菌素的顯著特點是：藥效持久，難以確定休藥期，在動物體內(nèi)殘留的時間比較長。按WHO五級分類標準，阿維菌素類仍屬高毒化合物［3］。美國、歐盟、食品法典委員會（CAC）和中國等均制定了阿維菌素類藥物的殘留限量，CAC和許多國家對該類化合物的殘留限量為10 μg/kg［4］，2002年12月我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文規(guī)定在所用牛肌肉和奶中殘留限量也是10 μg/kg［5］。

目前阿維菌素試劑盒前處理方法存在基質(zhì)影響大，檢測限偏高，回收率較低的問題［6］。為提高試劑盒的性能，本研究改進了阿維菌素的前處理方法，以期提高阿維菌素試劑盒的性能，使試劑盒能夠更準確的用于牛奶中阿維菌素殘留的快速測定。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗樣品

牛奶為市售產(chǎn)品。

2.1.2試劑

乙腈（分析純）、正己烷（分析純）、甲醇（分析純）等生化試劑：上海華美公司；阿維菌素酶聯(lián)免疫試劑盒：北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

2.1.3儀器

酶標儀MK3、微量移液器：美國Thermo公司；生化培養(yǎng)箱：天津中環(huán)實驗電爐有限公司；漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；氮吹儀：美國Organomation；低速離心機：上海安亭科學廠。

2.2方法

2.2.1PBS緩沖液配制

1 000 mL去離子水加入NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4·12H2O 5.8 g，KH2PO40.4 g。

2.2.2改進前樣品處理方法

取3mL牛奶于50mL離心管中，依次加入9 mL乙腈、3 mL正己烷，充分渦動1 min；15℃，4 000 r/min離心10 min；吸取下層1 mL于離心管中，60℃水浴中氮氣吹干；加入1 mL樣品稀釋液（PBS緩沖液），充分渦動1 min，取50 μL進行檢測。

2.2.3改進后樣品處理方法

取1 mL牛奶于10 mL離心管中，加入3 mL甲醇，高速渦動1 min；25℃，4 000 r/min離心10 min；取1mL上清于4mL離心管中，50℃水浴中氮氣吹干；加入0.5 mL含25%甲醇的緩沖液，充分渦動1 min；取50 μL進行檢測。

2.2.4前處理方法效果驗證

分別對兩種前處理方法進行基質(zhì)效應(yīng)、檢測限、準確度、精密度以及實際樣品檢測符合率進行驗證。

3 結(jié)果

3.1基質(zhì)效應(yīng)測試

分別檢測PBS緩沖液、兩種樣品處理方法的處理液對繪制標準曲線的影響。將阿維菌素標準品分別溶于3種基質(zhì)溶液中，配制成濃度為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L標準液，按照試劑盒的操作方法測定，繪制曲線進行分析。PBS緩沖液、改進前牛奶處理液和改進后牛奶處理液3種基質(zhì)溶液所測定標準曲線的IC50分別為1.9 μg/L、2.3 μg/L和1.9 μg/L，結(jié)果見圖1。

圖1　不同基質(zhì)溶液對試劑盒標準曲線影響

結(jié)果顯示，PBS緩沖液與改進后牛奶處理液各濃度標準品OD值、IC50差異不大，而與改進前牛奶處理液差距相對較大，因此，改進后方法更適用于牛奶樣品的前處理。

3.2試劑盒檢出限比較

用ELISA試劑盒分別檢測20份以兩種前處理方法處理的陰性牛奶樣品，計算樣品中阿維菌素的濃度。檢出限等于陰性樣品檢測濃度的平均值加上陰性樣品檢測濃度的3倍標準差，即：

檢出限=x+3s

式中：x為20份陰性樣品濃度平均值，s為20份陰性樣品的標準差。

測定結(jié)果見表1。改進前處理方法檢測牛奶中阿維菌素的檢出限計算值為2.7 μg/L，改進后處理方法檢測牛奶中阿維菌素的檢出限計算值為1.7 μg/L?？紤]到實際檢測中操作方面的誤差，改進前和改進后試劑盒的檢出限分別確定為3.0 μg/L和2.0 μg/L。

表1　檢出限測定結(jié)果

3.3準確度和精密度測試

準確度和精密度分別以回收率和變異系數(shù)（CV）表示。在陰性牛奶中添加不同濃度的阿維菌素標準品，每個濃度添加5份，按照改進后處理方法檢測牛奶樣本，計算樣品回收率和變異系數(shù)，以評價試劑盒的準確度和精密度，結(jié)果見表2。

表2　準確度和精密度測定結(jié)果

結(jié)果顯示，回收率范圍在75.8%-104.8%之間，批內(nèi)變異系數(shù)≤12.7%，批間變異系數(shù)≤14.2%，均未超過15%，表明阿維菌素試劑盒具有較高的準確度和精密度。

3.4實際樣品檢測結(jié)果

用ELISA試劑盒分別檢測10份以2種前處理方法處理的牛奶樣品，計算樣品中阿維菌素的濃度。對于檢測濃度≥5 μg/L的樣品用LC-MS/MS方法進行確證，考察前處理方法的可靠性。LC-MS/MS方法參照GBT 22968-2008《牛奶和奶粉中伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進行。檢測結(jié)果見表3。

表3　ELISA法檢測實際樣品結(jié)果

結(jié)果顯示，與改進前處理方法相比，改進后處理方法處理后的牛奶樣品檢測值普遍偏大；與儀器方法相比，改進前處理方法的檢測結(jié)果偏離較大，因此改進后處理方法的檢測結(jié)果具有較高可信度，更適合用于牛奶中阿維菌素殘留的檢測。

4 討論

（1）基質(zhì)效應(yīng)性可能抑制免疫結(jié)合反應(yīng)，使競爭效率下降，表現(xiàn)為曲線異常，斜率減小，IC50增大，靈敏度下降，如果基質(zhì)干擾嚴重，則需要對樣品前處理增加凈化步驟或者對處理液進行適當稀釋。本研究對牛奶中阿維菌素檢測方法進行了探索，改進了前處理方法，減少了基質(zhì)效應(yīng)性，增加了試劑盒檢測可信度。

（2）ELISA試劑盒靈敏度高，重復(fù)性好，檢測時間短，樣品前處理簡單，儀器化程度低，可以進行定性和定量檢測，非常適合于現(xiàn)場監(jiān)控及大樣品量的初篩。但也存在假陽性的問題，因此檢測為陽性的樣品需要用LC-MS、GC-MS等儀器法進一步確證。

（3）ELISA檢測方法作為一種快速篩查的手段，能夠監(jiān)測畜牧養(yǎng)殖中抗生素使用情況，從源頭上阻止不合格牛奶進入生產(chǎn)和流通環(huán)節(jié)，為人們食用安全優(yōu)質(zhì)的奶制品提供一種新的技術(shù)保障手段。可滿足相關(guān)殘留檢測國家標準，能滿足我國市場和進出口食品檢測需要。

5 結(jié)論

本項目在優(yōu)化前處理方法的前提下，研制出用于檢測牛奶樣品中阿維菌素殘留的ELISA試劑盒。該試劑盒的線性工作范圍為0.5-40.5 μg/L，IC50為1.9 μg/L，對牛奶的檢出限為2.0 μg/L；添加回收率范圍為75.8%-104.8%，批內(nèi)變異系數(shù)不大于12.7%，批間變異系數(shù)不大于14.2%，均未超過15%。試劑盒性能良好，可用于牛奶中阿維菌素殘留的定性或半定量檢測。

［1］朱娟娟.阿維鏈霉菌孢子色素生物合成及PhoR-PhoP雙組分信號系統(tǒng)對阿維菌素產(chǎn)量的影響［D］.華中農(nóng)業(yè)大學，2008.

［2］許其華.阿維菌素對羊寄生蟲的驅(qū)殺試驗［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，12：122-122.

［3］楊紹誼，崔濤，趙源，等.超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測牛奶中阿維菌素類毒素殘留［J］.中國乳品工業(yè)，2012，40（8）：47-49.

［4］趙衛(wèi)東，鄭文杰，賀艷，等.酶聯(lián)免疫法檢測動物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30（4）：127-130.

［5］曹愛華，孫惠青，徐金麗，等.甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在煙草及土壤中殘留分析方法的研究［J］.中國煙草科學，2010，31（4）：64-68.

［6］農(nóng)業(yè)部.動物性食品中獸藥最高殘留限量［Z］.農(nóng)業(yè)部2002年235號公告.

［7］范國英，王順崗，王自良，等.鏈霉素殘留檢測ELISA試劑盒的研制及應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2008，39（3）：380-384.

Establishment of Pretreatment method for the Determination of Avermectins in Milk

Liu Ying1，Wu Xiaoping2*，Su Lifang2，Wang Wenjun2，Chen Yinhui2
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026；2.Beijing WDWK Biotechnological Corporation Ltd）

Toimproveavermectinspretreatmentmethodinmilksample，post-processingliquidas standard matrix was used to draw standard curve.The result showed IC50value was 1.9 μg/L same as PBS buffer measurements.The limit of detection（LOD）was 2.0 μg/L.The average recoveries of milk samples ranged between 75.8%-104.8%.Coefficients of variation（CVs）were not more than 15.0%.Two pretreatment methods were used to test the actual samples and result displayed values of post-processing method was closer to the instrument readings.So the kit can meet the national standard residue detection and can be applied in the market and entry-exit food testing.

Abamectin；Pretreatment；ELISA Kit；Milk

R446.61

E-mail：liuying@bjciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：wuxiaoping@wdwkbio.com

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2013IK306）

2015-06-09