王靖　李智敏　謝純良等

摘要：從快速腐爛的苧麻基質(zhì)中篩選到1株產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株F1-1，分析該菌株的遺傳背景，并對其產(chǎn)酶條件進行了優(yōu)化，以期為下一步纖維素生產(chǎn)燃料乙醇技術(shù)的研發(fā)提供新的菌種資源。結(jié)果表明，F(xiàn)1-1菌株為Bacillus屬，其最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為醋酸纖維素1.0%、纖維二糖0.8%、木糖0.5%、葡萄糖0.2%、麥麩1.2%、玉米粉0.6%、KNO3 0.4%、MgSO4 0.2%、CaCl2 0.05%、NaH2PO4 0.05%和Na2HPO4 0.05%。最佳發(fā)酵條件為35～37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，纖維素酶活力由優(yōu)化前的103.20 U/mL提高到優(yōu)化后的646.53 U/mL。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；菌株F1-1；產(chǎn)酶條件優(yōu)化；苧麻；燃料乙醇

中圖分類號：S182 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4790-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.034

Abstract： Strain F1-1， which can produce cellulose， was screened from rapidly-corrupted ramie matrix. In order to provide new strain resource for the further research of the technology to produce fuel ethanol from fiber， the strains genetic background was analyzed and its fermentation conditions were optimized. The results showed that strain F1-1 belongs to Bacillus. The optimal medium contained 1.0% cellulose acetate， 0.8% cellobiose， 0.5% xylose， 0.2% glucose， 1.2% wheat bran， 0.6% corn flour， 0.2% KNO3， 0.2% MgSO4， 0.05% CaCl2， 0.05% NaH2PO4 and 0.05% Na2HPO4. The optimal fermentation condition was shake cultivation about 72 hours at 35～37 ℃ and 170 r/min. By optimization， the enzyme activity increased from 103.20 U/mL to 646.53 U/mL.

Key words： cellulase；strain F1-1； optimization of fermentation conditions； ramie； fiber ethanol

為了應(yīng)對能源危機，世界各國都在開發(fā)高效、清潔的可再生資源，其中發(fā)展最快的是燃料乙醇，利用農(nóng)業(yè)廢棄物等木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇已成為研究的熱點和趨勢[1-3]。農(nóng)作物秸稈的主要結(jié)構(gòu)是木質(zhì)素、半纖維素、纖維素，其中，纖維素含量最高[4，5]。生產(chǎn)燃料乙醇首先要對農(nóng)作物秸稈進行降解，各降解法中以酶水解方式最具優(yōu)勢[6]，尤其是纖維素酶用量最多。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，是一種復(fù)合酶，作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產(chǎn)物[7]。纖維素酶大致由3個組分構(gòu)成，分別為外切葡聚糖纖維二糖水解酶（CBH）、內(nèi)切葡聚糖酶（EG）和β-葡萄糖苷酶（CB）。EG對葡聚糖鏈進行隨機切割，生成較小的寡聚糖；然后由CBH對寡聚糖的非還原端進行水解，生成纖維二糖；再由CB把纖維二糖降解成葡萄糖，從而完成纖維素的完全降解[8，9]。除了用于生產(chǎn)燃料乙醇，纖維素酶在環(huán)境行業(yè)、食品行業(yè)、飼料行業(yè)以及日用品行業(yè)等均有廣泛的應(yīng)用，是一種重要的工業(yè)用酶。目前纖維素酶產(chǎn)業(yè)存在的主要問題是生產(chǎn)成本較高[10]，因此仍需要加強對纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育，為工業(yè)生產(chǎn)提供更多研究技術(shù)和解決方法。

本研究擬從不同來源的樣品中篩選產(chǎn)纖維素酶的菌株，通過對其固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，為纖維素酶應(yīng)用乃至纖維燃料乙醇技術(shù)的研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌樣：取自麻園土、漚麻水、腐爛麻殼、漚麻塘泥、腐爛苧麻基質(zhì)、農(nóng)家肥、腐爛木材等。

主要試劑：木糖、醋酸纖維素鈉（上?？笊锛夹g(shù)有限公司）；木聚糖（Sigma公司）；纖維素二糖[（生工生物工程（上海）股份有限公司]；3，5-二硝基水楊酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

主要儀器：立式壓力蒸氣滅菌器（GR110DR型，ZEALWAY）；分光光度計（UV-2700，日本島津）；離心機（TGL-16C，Anke）；電熱恒溫水浴鍋（HH·SY21-Ni型，北京長源實驗設(shè)備廠）；電子分析天平（UX6200H型，日本島津）；氣浴恒溫振蕩器（THZ-82B，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B型，天津泰斯特儀器有限公司）；超純水器（RO-200型，臺灣艾柯）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與鑒定

1）初篩。每種樣品各取25 g放入三角瓶中，加入225 mL無菌水，130 r/min振蕩10 min，用3層紗布過濾除去可見雜質(zhì)。取濾液30 mL接種到LB培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。取1 mL菌液稀釋到10-4、10-5、10-6，涂布于篩選培養(yǎng)基（1% NaCl，0.5% 蛋白胨， 0.5%醋酸纖維素鈉， 1%瓊脂），28 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，挑取平板上水解斑較大的菌落。

2）菌種純化。將篩選出的菌落進行劃線分離，純化出單菌落。測量菌落大小和水解斑直徑，挑取菌落大、產(chǎn)酶旺盛的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

3）菌種鑒定。設(shè)計引物對菌株的16S rDNA序列進行克隆，測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。引物序列為F：5′-CTTGCTCCCTGATGTTAGACGGCGG-3′；R：5′-ACTTCGGGTGTTACAAACTC

TCGT-3′。

1.2.2 固體培養(yǎng)基成分優(yōu)化 通過設(shè)計正交L9（34）試驗初步優(yōu)化碳源和氮源的組合與添加量，利用培養(yǎng)基上水解斑的大小判斷酶活性的大小。固定醋酸纖維素添加量為1.0%，胰蛋白胨和酵母提取物添加量總和為1.0%，無機鹽添加量為0.2% MgSO4、0.05% CaCl2、0.05% NaH2PO4和0.05% Na2HPO4。通過調(diào)整纖維素二糖（0.4%、0.8%、1.2%）、木糖（0、0.3%、0.5%）、葡萄糖（0.2%、0.6%、1.2%）和胰蛋白胨（0、0.6%、1.0%）添加量進行優(yōu)化，32 ℃培養(yǎng)3 d。

1.2.3 半固體培養(yǎng)基成分優(yōu)化 根據(jù)固體培養(yǎng)基優(yōu)化試驗結(jié)果，固定纖維素二糖、木糖和無機鹽等成分添加量，通過設(shè)計正交L9（34）試驗對葡萄糖（0、0.1%、0.2%）、麥麩（0.2%、0.6%、1.2%）、玉米粉（0.2%、0.6%、1.2%）和硝酸鉀（0.2%、0.4%、0.8%）添加量進行優(yōu)化，32 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液經(jīng)離心收集酶的初提液，用DNS法[11]測定纖維素酶活性。

1.2.4 培養(yǎng)條件單因子優(yōu)化 根據(jù)半固體培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)果，進一步考察發(fā)酵時間、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度對酶活性的影響。①發(fā)酵時間。固定培養(yǎng)基，在32 ℃、150 r/min的條件下，分別在發(fā)酵1、2、3 、4 d時取樣，分離初提酶液，測定纖維素酶活性。②轉(zhuǎn)速。由于培養(yǎng)到第三天時酶活性基本達到較高水平，因此在固定培養(yǎng)基和32 ℃、發(fā)酵3 d的條件下考察搖床轉(zhuǎn)速（100、170、220 r/min）對酶活性的影響。③培養(yǎng)溫度。固定培養(yǎng)基，在170 r/min發(fā)酵3 d 的條件下，對培養(yǎng)溫度（28、32、35、37 ℃）進行優(yōu)化。

1.2.5 酶活性測定 以含0.4%誘導(dǎo)底物（醋酸纖維素鈉）、0.5%酵母提取物、0.5%胰蛋白胨和 0.5% NaCl為培養(yǎng)基，接種后在30 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液的酶活性。取1 mL發(fā)酵液以6 000 r/min離心5 min，吸取上清液0.5 mL與預(yù)熱到50 ℃的2 mL 1%羧甲基纖維素鈉鹽混合，在50 ℃保溫30 min。之后取0.5 mL反應(yīng)液與0.5 mL DNS試劑混合，放入沸水中5 min，然后加入4 mL去離子水混勻，在540 nm處測定其吸光度。1個酶活性單位（U）為l mL酶液反應(yīng)1 min生成1 μmol還原糖所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與鑒定結(jié)果

通過對各基質(zhì)菌株的篩選，最終從腐爛的苧麻基質(zhì)中篩選到適宜菌株，在初選培養(yǎng)基上有約10種細菌長勢良好，其中F1-1菌株的纖維素酶活力較高。對該菌株進行纖維素酶活性測定，其酶活性為103.20 U/mL。對克隆到的F1-1菌株的16S rDNA序列進行測序，結(jié)果（圖1）顯示，其序列長1 38 2 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與Bacillus屬菌株有99%的相似性。

2.2 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 固體培養(yǎng)基成分的優(yōu)化結(jié)果 固體培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果如表1所示。由表1可知，所用固體培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果為醋酸纖維素1.0%、纖維二糖0.8%、木糖0.5%、葡萄糖0.2%、胰蛋白胨0.6%、酵母提取物0.4%、MgSO4 0.2%、CaCl2 0.05%、NaH2PO4 0.05%和Na2HPO4 0.05%，此時水解斑半徑最大為1.7 cm。優(yōu)化后的水解斑加大，效果明顯，如圖2所示。

2.2.2 半固體培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)果 半固體培養(yǎng)基正交試驗優(yōu)化結(jié)果見表2。由表2可知，優(yōu)化試驗各組合中纖維素酶活性最高可達613.44 U/mL。在試驗范圍內(nèi)F1-1的纖維素酶活性隨著葡萄糖、麥麩和玉米粉添加量的增加而提高，而硝酸鉀添加量在0.4%時最適合。

2.2.3 培養(yǎng)條件單因子優(yōu)化結(jié)果 不同培養(yǎng)時間對纖維素酶活性的影響見圖3。由圖3可知，培養(yǎng)1 d時纖維素酶活性最低，可能因菌體數(shù)量較少，隨著培養(yǎng)時間的延長，纖維素酶活性逐步提高，培養(yǎng)3 d時F1-1菌株的纖維素酶活性接近600 U/mL，培養(yǎng)4 d時纖維素酶活性達到622.68 U/mL。

轉(zhuǎn)速對F1-1菌株的纖維素酶活性的影響見圖4。由圖4可知，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時F1-1菌株的纖維素酶活性可達636.44 U/mL，轉(zhuǎn)速為170 r/min時纖維素酶活性為621.25 U/mL，而轉(zhuǎn)速為100 r/min時纖維素酶活性只有409.60 U/mL。

培養(yǎng)溫度對纖維素酶活性的影響見圖5。由圖5可知，培養(yǎng)溫度為35 ℃和37 ℃時纖維素酶活性分別達到了645.22 U/mL和646.53 U/mL，而培養(yǎng)溫度為32 ℃和28 ℃時纖維素酶活性較低。可見最適的培養(yǎng)溫度在35～37 ℃。F1-1菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化后纖維素酶活性達到了646.53 U/mL。

3 小結(jié)與討論

本研究從麻類來源的不同樣品中進行產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選，獲得產(chǎn)纖維素酶活力較高的F1-1菌株，該菌株初始纖維素酶活性為103.20 U/mL。通過對F1-1菌株的固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等進行優(yōu)化，使其纖維素酶活性最終達到646.53 U/mL；確定其最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為醋酸纖維素1.0%、纖維二糖0.8%、木糖0.5%、葡萄糖0.2%、麥麩1.2%、玉米粉0.6%、KNO3 0.4%、MgSO4 0.2%、CaCl2 0.05%、NaH2PO4 0.05%和Na2HPO4 0.05%；最佳培養(yǎng)條件是35～37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

固體培養(yǎng)基優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)葡萄糖添加量升高不利于F1-1菌株的纖維素酶活性提高，而纖維二糖和木糖添加量的適當(dāng)提高有助于提高該菌株產(chǎn)纖維素酶活性。培養(yǎng)條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時酶活性較低，這可能跟半固體培養(yǎng)基的分散狀態(tài)有關(guān)，轉(zhuǎn)速低時培養(yǎng)基內(nèi)非溶解性的固體顆粒物質(zhì)沉在底部，不利于發(fā)酵。

麻類纖維是人類最早利用的紡織纖維之一，從快速腐爛的麻類作物中有利于篩選到產(chǎn)纖維素酶的菌種。相對于其他纖維作物，也可以篩選到一些具有種屬特異性的新型菌株，為下一步纖維燃料乙醇技術(shù)的研發(fā)提供新的菌種資源。

參考文獻：

[1] JOHN M J， THOMS S. Biofibres and biocomposites[J]. Carbohydrate Polymers， 2008， 71（3）： 343-364.

[2] VENTURI P， VENTURI G. Analysis of energy comparison for crops in European agricultural systems[J]. Biomass and Bioenergy， 2003， 25（3）： 235-255.

[3] PERLACK R D， WRIGHT L L， TURHOLLOW A F， et al. Biomass as a feedstock for a bioenergy and bioproducts industry： The technical feasibility of a billion-ton annual supply[EB/OL]. http：//wwwostigov/bridge.

[4] 李里特，丁長河，江正強，等.一株產(chǎn)木聚糖酶鏈霉菌的鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶[J].微生物學(xué)通報，2003，30（6）：59-64.

[5] RONDEAU-MOURO C， BOUCHET B， PONTOIRE B， et al. Structural features and potential texturising properties of lemon and maize cellulose microfibrils[J]. Carbohydrate Polymers， 2003， 53（3）： 241-252.

[6] 李素波.纖維素酶高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2008.

[7] 何國慶，丁立孝.食品酶學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[8] 趙小蓉，林啟美，孫炎鑫，等.纖維素分解菌對不同纖維素類物質(zhì)的分解作用[J].微生物學(xué)雜志，2000，20（3）：12-14.

[9] 史 央，蔣愛芹，戴傳超，等.秸稈降解的微生物學(xué)機理研究及應(yīng)用進展[J].微生物學(xué)雜志，2002，22（1）：47-50.

[10] 呂春娥.稻草纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010.

[11] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducingsugar[J].Anal Chem， 1959， 31（3）： 426-428.