付書林　陳夏冰　何斌等

摘要：以副豬嗜血桿菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxA/R中反應(yīng)調(diào)節(jié)因子CpxR為研究對(duì)象，成功構(gòu)建自殺性質(zhì)粒ΔpEM-CpxR，這就為構(gòu)建副豬嗜血桿菌CpxR突變株以及探究CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控副豬嗜血桿菌分子致病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；反應(yīng)調(diào)節(jié)因子；CpxR；自殺性質(zhì)粒

中圖分類號(hào)：S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）19-4787-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.033

Abstract：Haemophilus parasuis （H. parasuis）， the causative agent of swine polyserositis， polyarthritis， and meningitis， is one of the most important bacterial diseases of pigs worldwide. The response regulator CpxR of two-Component Transduction System CpxA/R of H. parasuis was studied and the suicide plasmid ΔpEM-CpxR was successfully constructed， which providing the basis of constructing CpxR gene deletion mutant and exploring the TCS of CpxA/CpxR regulating the molecular pathogenesis of H. parasuis.

Key words： Haemophilus parasuis； response regulator； CpxR； suicide plasmid

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， HPS）引起豬的革拉氏疾病，臨床特征以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為主要特征。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬技術(shù)的應(yīng)用和飼養(yǎng)高度密集化，由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病已經(jīng)成為當(dāng)前豬場(chǎng)最重要的細(xì)菌性傳染病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Two-component transduction system， TCS）是細(xì)菌中廣泛存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在病原菌中起著“神經(jīng)系統(tǒng)”作用。經(jīng)典的雙組分模式是由膜上的組氨酸激酶（Histine kinase， HK）和胞質(zhì)上的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（Response regulator， RR）組成[2]。應(yīng)用序列相似性比較及功能域分析，表明在HPS-SH0165全基因組序列中存在CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。本試驗(yàn)成功構(gòu)建HPS反應(yīng)調(diào)節(jié)因子CpxR自殺性質(zhì)粒，為構(gòu)建CpxR基因缺失突變株提供前期基礎(chǔ)，同時(shí)也為探究CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控副豬嗜血桿菌分子致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、Ex Taq/LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、RNase酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloramphenicol， Cm）均購(gòu)自美國(guó)英駿公司。DNA回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯（Tryptic SoyBroth，TSB）粉劑購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson and Company公司。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 副豬嗜血桿菌血清5型SH0165菌株和自殺性質(zhì)粒pEMOC2由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 SH0165菌株中CpxR基因上下游同源臂的擴(kuò)增與鑒定 參照已測(cè)序HPS血清5型SH0165菌株基因組序列，設(shè)計(jì)Cpx1、Cpx2、Cpx3、Cpx4兩對(duì)引物，擴(kuò)增CpxR基因的上下游同源臂。以SH0165菌株為模板進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)、回收，連接到pMD-18T載體上，并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-CpxR的構(gòu)建 將測(cè)序正確的T-P1用限制酶XbaI、SalI從pMD18-T載體切下，連接到經(jīng)相同酶酶切的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEMOC2上，然后轉(zhuǎn)換提取重組質(zhì)粒pEM-P1，再將測(cè)序正確的T-P2用NotI、XbaI從pMD18-T載體切下，連接到經(jīng)相同酶酶切的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-P1上去，轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒鑒定正確，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-CpxR。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙組分調(diào)控系統(tǒng)CpxA/R基因結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，HPS血清5型菌株SH0165測(cè)序結(jié)果顯示，CpxA、CpxR兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄方向一致，基因相靠近，進(jìn)化比較保守。

2.2 CpxR基因上下游同源臂的擴(kuò)增

以SH0165菌株基因組為模板擴(kuò)增CpxR基因的上、下游同源臂，分別為1 030、998 bp。與預(yù)期結(jié)果大小相同?；厥占兓⒛康钠芜B接到pMD-18T載體上，送上海生工有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明與公布序列相比相似性為100%（圖2、圖3）。

2.3 重組轉(zhuǎn)移自殺性質(zhì)粒pEM-CpxR的構(gòu)建與鑒定

將測(cè)序正確的CpxR基因下游同源臂與自殺性質(zhì)粒pEMOC2載體用NotI/XbaI雙酶切，回收下游同源臂和pEMOC2載體，用T4連接酶進(jìn)行過夜連接，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-P2，并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒用NotI/XbaI雙酶切進(jìn)行鑒定，顯示998 bp左右的目的片段，與下游同源臂相符合，結(jié)果表明質(zhì)粒pEM-P2構(gòu)建成功（圖4）。

然后，再將測(cè)序正確CpxR基因上游同源臂與質(zhì)粒pEM-P2用SalI/XbaI酶進(jìn)行雙酶切，回收純化上游同源臂和pEMOC2載體，并用T4連接酶進(jìn)行過夜連接，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-CpxR。并轉(zhuǎn)化DH5α菌株，提取質(zhì)粒，經(jīng)NotI/SalI雙酶切鑒定，與目的片段2 028 bp大小相一致的片段，結(jié)果表明，重組自殺性質(zhì)粒pEM-CpxR構(gòu)建成功（圖5）。

3 討論

CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)屬于OmpR家族，可以通過感應(yīng)細(xì)菌外膜的壓力，參與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的折疊以及蛋白質(zhì)的降解[3]。在杜克雷嗜血桿菌研究中發(fā)現(xiàn)，它能夠控制毒力相關(guān)因子lspB-lspA2、flp、dsrA的表達(dá)[4]，CpxA的磷酸化使杜克雷嗜血桿菌的毒力相關(guān)因子上調(diào)表達(dá)[5]。在致病性大腸桿菌和志賀菌屬中，CpxA/CpxR能夠決定毒力相關(guān)因子的表達(dá)[6]。Hung等[7]通過構(gòu)建CpxR突變株，表明CpxA/CpxR能夠影響大腸桿菌P菌毛的合成，在缺少葡萄糖培養(yǎng)基中，CpxA-P可以作用于毒力相關(guān)因子pap基因的上游從而使該基因上調(diào)表達(dá)。病原微生物在侵入宿主引起發(fā)病過程中，能夠通過CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)感受體內(nèi)外各種信號(hào)的變化，繼而調(diào)節(jié)相關(guān)基因進(jìn)行反應(yīng)以完成其致病過程。因此，CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在病原菌致病過程中起著重要作用。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建副豬嗜血桿菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxA/CpxR兩個(gè)單基因CpxA、CpxR突變株，詳細(xì)研究雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxA/CpxR調(diào)控副豬嗜血桿菌致病性的機(jī)理。探究副豬嗜血桿菌CpxA/CpxR雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控致病性的分子機(jī)制研究，一方面可以詮釋關(guān)鍵生命活動(dòng)的調(diào)控機(jī)理，另一方面還可以闡明副豬嗜血桿菌的分子致病機(jī)制，為開發(fā)副豬嗜血桿菌新型分子疫苗和藥物提供基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] OLVERA A， SEGAL?S J， ARAG?N V. Update on the diagnosis of Haemophilus parasuis infection in pigs and novel genotyping methods [J]. Vet J， 2007， 174（3）：522-529.

[2] CASINO P， MIGUEL-ROMERO L， MARINA A. Visualizing autophosphorylation in histidine kinases[J]. Nat Commun， 2014， 5：3645.

[3] HUNKE S， KELLER R， M?LLER V S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system[J]. FEMS Microbiol Lett， 2012， 326（1）：12-22.

[4] LABANDEIRA-REY M，BRAUTIGAM C A，HANSEN E J. Characterization of the CpxRA regulon in Haemophilus ducreyi[J]. Infect Immun， 2010， 78（11）：4779-4791.

[5] GANGAIAH D， ZHANG X， FORTNEY K R， et al. Activation of CpxRA in Haemophilus ducreyi primarily inhibits the expression of its targets， including major virulence determinants[J]. J Bacteriol， 2013， 195（15），3486-3502.

[6] TOBE T. The roles of two-component systems in virulence of pathogenic Escherichia coli and Shigella spp[J]. Adv Exp Med Biol， 2008， 631：189-199.

[7] HUNG D L， RAIVIO T L， JONES C H，et al. Cpx signaling pathway monitors biogenesis and affects assembly and expression of P pili[J]. EMBO J，2001，20（7）：1508-1518.