孫艷發(fā)　張敏　戴愛玲等

摘要：為了解福建省某公豬站布氏桿菌病情況，采用平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)相結(jié)合的方法以及PCR診斷方法，對(duì)該站50頭種公豬進(jìn)行布氏桿菌病診斷。經(jīng)平板凝集試驗(yàn)篩選，檢出疑似陽(yáng)性血清樣本14份，經(jīng)試管凝集試驗(yàn)復(fù)檢，確診陽(yáng)性血清樣本4份。為進(jìn)一步確診疑似病例，采用PCR診斷方法，在剩下的10份疑似陽(yáng)性血清樣本中確診2份。

關(guān)鍵詞：豬布氏桿菌病；平板凝集試驗(yàn)；試管凝集試驗(yàn)；PCR

中圖分類號(hào)：S828；S852.61+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）19-4777-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.030

Abstract： In order to understand the state of Porcine Brucellosis of an Boar Station in Fujian Province， the Plate Agglutination Test and Tube Agglutination Test was used to detect the serum samples collected from boars， as well as Polymerase Chain Reaction （PCR） which was used to test the brucella in sperm of boars.14 serum samples were found positive by the Plate Agglutination Test， then 4 serum samples were confirmed positive by tube agglutination test. Except for the 4 positive samples， 2 out of the 10 samples were confirmed positive by PCR.

Key words： porcine brucellosis；plate agglutination test；tube agglutination test； PCR

布氏桿菌病是動(dòng)物源性人獸共患病，《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》將其列為乙類傳染病，《家畜家禽防疫條例實(shí)施細(xì)則》將其列為二類動(dòng)物疫病[1]。該病由布氏桿菌感染引起，包括羊種、牛種、豬種、綿羊型副睪種、沙林鼠種和犬種，其中羊種布氏桿菌、牛種布氏桿菌和豬種布氏桿菌危害較大[2]。布氏桿菌病有多種診斷方法，各檢查方法均有較完備的實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)采用血清學(xué)診斷中平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，以及PCR診斷技術(shù)對(duì)福建省某公豬站全部公豬進(jìn)行布氏桿菌病檢測(cè)，以淘汰布氏桿菌感染種公豬，確保公豬站無該病流行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 對(duì)福建省某公豬站50頭未免疫布氏桿菌疫苗的公豬進(jìn)行前腔靜脈采血并分離血清，同時(shí)采取精液，編號(hào)，置4 ℃冰箱待檢。

1.1.2 藥品及配制 平板凝集抗原、試管凝集抗原、布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清購(gòu)自中國(guó)疾病與控制中心。石碳酸、NaCl、EDTA、Tris-HCl由福建省龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所提供。Taq DNA 聚合酶、dNTP和2 000 bp Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海華津有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 平板凝集試驗(yàn) 按照《布氏桿菌病平板凝集試驗(yàn)操作規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)》中的技術(shù)要求進(jìn)行操作及結(jié)果判定[3]。

1.2.2 試管凝集試驗(yàn) 按照農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——?jiǎng)游锊际蠗U菌病診斷技術(shù)》中規(guī)定的技術(shù)要求進(jìn)行操作及結(jié)果判定[4]。

1.2.3 PCR檢測(cè)方法 按照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)》中的技術(shù)要求進(jìn)行操作及結(jié)果判定[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)診斷結(jié)果

運(yùn)用血清學(xué)方法對(duì)福建省某公豬站50頭公豬布氏桿菌病情況進(jìn)行確診，平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，平板凝集試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品有5、9、13、14、16、18、20、22、26、27、29、35、44、46，共14份；試管凝集試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品有14、26、29、44，共4份。根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布氏桿菌病診斷技術(shù)》GB/T18646-2002規(guī)定，判定編號(hào)14、26、29、44為布氏桿菌感染豬只，編號(hào)5、9、13、16、18、20、22、27、35、46的為疑似布氏桿菌感染豬只，需再次檢測(cè)。

2.2 PCR診斷結(jié)果

運(yùn)用PCR方法對(duì)公豬精液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1-圖4。由圖1-圖4可知，13、14、16、26、29、44均出現(xiàn)419 bp的帶，為陽(yáng)性。其中14、26、29、44與試管凝集試驗(yàn)疑似相符。而在疑似陽(yáng)性的10份樣品中只有13、16通過PCR方法確診為陽(yáng)性。

3 討論

布氏桿菌病是目前世界上流行最廣、危害最大的人畜共患病之一。其一方面直接威脅人民身體健康和公共安全，另一方面影響動(dòng)物以及動(dòng)物性產(chǎn)品的貿(mào)易，阻礙畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。布氏桿菌病病原是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，抗生素對(duì)其效果較差，故該病防控以預(yù)防為主。對(duì)感染動(dòng)物淘汰是最為理想的方法，因此做出準(zhǔn)確診斷尤為重要。

布氏桿菌病的經(jīng)典血清學(xué)診斷方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，這些試驗(yàn)在生產(chǎn)中各有利弊?；⒓t平板凝集試驗(yàn)最為簡(jiǎn)單，但就是因?yàn)檫^于簡(jiǎn)單，其特異性較低，受試驗(yàn)溫度和凝集時(shí)間相對(duì)較短的影響，不易準(zhǔn)確判斷結(jié)果。所以用平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)為陽(yáng)性者還要經(jīng)過其他血清學(xué)方法進(jìn)行確診，才能最終判斷為陽(yáng)性[6]。試管凝集試驗(yàn)是中國(guó)法定的診斷布氏桿菌病的方法，其準(zhǔn)確性較高，但繁瑣費(fèi)時(shí)，不適于現(xiàn)場(chǎng)操作。目前臨床上多采取先用平板凝集試驗(yàn)初篩，再用試管凝集試驗(yàn)確診的診斷思路。另外，20世紀(jì)90年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)已成為布氏菌病檢測(cè)與診斷應(yīng)用較多的方法。

本研究采用平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)相結(jié)合的方法，最終得到診斷結(jié)果為該公豬站50頭種公豬中，編號(hào)為14、26、29、44的豬只為布氏桿菌感染豬只，編號(hào)為5、9、13、16、18、20、22、27、35、46的豬只為疑似布氏桿菌感染豬只，須再次檢測(cè)。本試驗(yàn)參照《奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)》對(duì)公豬站50頭種公豬精液進(jìn)行診斷，檢測(cè)出陽(yáng)性條帶的樣品為13、14、16、26、29、44。其中14、26、29、44與試管凝集試驗(yàn)結(jié)果完全相符。在疑似陽(yáng)性病料中確診2份陽(yáng)性，分別為13、16號(hào)樣品。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王金良，沈志強(qiáng).布氏桿菌病研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2008（6）：58-60.

[2] 趙忠鵬，王希良.布氏桿菌毒力因子研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2007，35（1）：50-53.

[3] SN/T 1088-2002，布氏桿菌病平板凝集試驗(yàn)操作規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)[S].

[4] GB/T 18646-2002，中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——?jiǎng)游锊际蠗U菌病診斷技術(shù)[S].

[5] NY/T 1467-2007，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)[S].

[6] 孫耀貴，黃姜生，陳 佳.三種血清學(xué)方法檢測(cè)奶牛布魯氏菌病的比較試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005（1）：42-43.