李國攀　熊萍萍　榮俊

摘要：為了在多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）中高效表達外源基因，克隆了天冬酰氨合成酶A（asnA）基因的啟動子PasnA和終止子TasnA，雙酶切獲取pUC18質(zhì)粒的多克隆位點，將這3個片段組裝成一個可以方便插入外源基因的表達元件。測序結果分析表明，PasnA是巴氏桿菌asnA基因的強啟動子，具有原核生物典型的Pribnow盒和SD序列。pUC18的多克隆位點mcs具有多個核酸限制性內(nèi)切酶的單一切點，便于外源基因的插入。TasnA是巴氏桿菌asnA基因的強終止子，具有很好的回文結構，在發(fā)卡結構后面有一段富含A/T區(qū)。3個片段表達元件（PcmsT）的構建為完整的巴氏桿菌-大腸桿菌穿梭表達質(zhì)粒的構建奠定了基礎。

關鍵詞：多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）；表達元件；天冬酰氨合成酶A基因；啟動子；終止子

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4847-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.050

Abstract： In order to express heterologous genes in Pasteurella multocida efficiently， PasnA （promoter of asparagine synthetase A，asnA）， mcs（multiple cloning sites from plasmid pUC18）， and TasnA（terminator of asnA） were cloned and ligated together to construct an expression element PcmsT. Sequence analysis showed that PmcsT had some unique restriction sites suitable for cloning in the frame. PasnA， the strong promoter of asnA gene from P. multocida， possessed typical prokaryotic structural characteristics， such as Pribnow box and SD sequence. TasnA， the strong terminator of asnA gene， had a perfect palindrome structure with an A/T-rich region following the hairpin structure. The expression element PcmsT could be used to construct an Escherichia coli- Pasteurella multocida shuttle plasmid in the future studies.

Key words： Pasteurella multocida； expression element； asparagine synthetase A gene （asnA）； promoter； terminator

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是革蘭氏陰性桿菌，主要通過呼吸道和消化道黏膜侵染動物，普通動物種群中有30%～80%是該菌的攜帶者[1，2]。多殺性巴氏桿菌攜帶內(nèi)源性質(zhì)粒是一個比較普遍的現(xiàn)象[3-6]，利用質(zhì)粒攜帶外源抗原基因至巴氏桿菌中表達，再通過巴氏桿菌對動物呼吸道和消化道的免疫器官遞呈抗原是一個基因工程疫苗研究的可行方式。目前，國內(nèi)外尚未見用巴氏桿菌表達異種抗原蛋白質(zhì)的報道。本研究旨在對巴氏桿菌表達外源蛋白質(zhì)的啟動子和終止子進行研究，構建一個能在巴氏桿菌中表達外源抗原蛋白質(zhì)的表達元件，使之成為未來構建巴氏桿菌活菌載體疫苗的研究工具或平臺。Boyce等[7]用熒光定量RT-PCR的方法分析了多殺性巴氏桿菌在感染試驗雞后基因組DNA表達量的變化情況，其中asnA、gdhA、ppc、napF等基因的表達量明顯提高?？刂七@些基因表達的啟動子都有可能成為控制多殺性巴氏桿菌表達的可用基因，提高其攜帶的外源基因在感染雞體內(nèi)的表達水平。啟動子是基因表達調(diào)控的重要順式元件，也是基因工程表達載體的一個重要部分[8]。雖然轉(zhuǎn)錄終止子在表達質(zhì)粒的構建過程中常被忽略，但有效的轉(zhuǎn)錄終止子也是表達元件中必不可少的組成部分。在研究過程中，選擇巴氏桿菌基因組中調(diào)控天冬酰胺合成酶A基因（asnA） 的啟動子、終止子序列作為外源基因表達的調(diào)控元件的核心組成，在啟動子和終止子之間插入來源于pUC質(zhì)粒的多克隆位點，構建了外源基因在巴氏桿菌中表達的調(diào)控元件，為巴氏桿菌-大腸桿菌穿梭表達質(zhì)粒載體的構建奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

禽多殺性巴氏桿菌G190E40菌株（C48-16）購自武漢中博生化有限公司生物制品廠；大腸桿菌DH5α由筆者所在實驗室保存。

1.2 主要藥品和試劑

限制性核酸內(nèi)切酶（BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoRⅠ、Sal Ⅰ）購自Ferments公司；EX TaqTM DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、pUC18質(zhì)粒、pMD18-T載體均為大連寶生物公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker購自華美生物工程公司；胰蛋白胨、酵母提取物為OXIOD公司產(chǎn)品；腦心浸出汁肉湯 （BHI）培養(yǎng)基為美國BD公司產(chǎn)品；小量膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購于上海華舜生物工程有限公司。

1.3 引物設計

參考May等[9]發(fā)布的多殺性巴氏桿菌全基因序列（AE006194）設計了啟動子（PasnA）和終止子（TasnA）各兩對引物，其序列如下：PasnA F：5′-CCCCGTCGACCTATAAAATTCAAAGTATAT-3′，PasnA R：5′-CCCGAATTCTTGTTGTTGTAAAATAAATGA-3′。在PasnA F的5′端添加一個SalⅠ的限制性內(nèi)切酶位點，在PasnA R的5′端添加一個EcoRⅠ的限制性內(nèi)切酶位點（下劃線所示）。TasnA F：5′-CCCAAGCTTTAATTATCGTTATTTGTTTCC-3′；TasnA R：5′-CCCGGATCCCGCAGTCCACCCTTTTTTTAT-3′。在TasnA F的5′端添加一個Hind Ⅲ的限制性內(nèi)切酶位點，在TasnA R的5′端添加一個BamHⅠ的限制性內(nèi)切酶位點（下劃線所示）。引物由生工生物工程（上海）技術服務有限公司合成。endprint

1.4 重組質(zhì)粒pMD18-T-PasnA和pMD18-T-TasnA的構建

用無菌槍頭取少許禽多殺性巴氏桿菌C48-16疫苗凍干粉于10 mL BHI培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h后劃板。挑取多殺性巴氏桿菌C48-16單菌落接種于10 mL BHI培養(yǎng)液中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。取0.2 mL菌液，10 000g離心1 min，棄上清，收集菌體。加入50 μL去離子水重懸菌體，100 ℃煮沸5 min，12 000g離心5 min，上清液即為DNA模板，用于PCR擴增。

分別用引物PasnA F和PasnA R、TasnA F和TasnA R從上述提取的模板中擴增片段PasnA和TasnA。擴增程序為：95 ℃ 變性5 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35循環(huán)； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因，在紫外燈下切下含有長度為158 bp和139 bp的目的片段，用小量膠回收試劑盒回收純化目的片段。將多殺性巴氏桿菌C48-16的asnA基因的啟動子PasnA和終止子TasnA的回收產(chǎn)物分別與載體pMD18-T進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。經(jīng)過PCR鑒定后，由生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。

1.5 PasnA-mcs-TasnA三聯(lián)體的構建

用EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切pUC18質(zhì)粒，回收純化57 bp的多克隆位點mcs；用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-PasnA，回收PasnA 片段（158 bp）；用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-PasnA，回收TasnA 片段（139 bp）。將回收的目的片段PasnA、TasnA和mcs用T4 DNA連接酶連接后，以連接產(chǎn)物為模板，PasnA F和TasnA R為引物進行PCR擴增，回收PasnA、TasnA和mcs片段的連接產(chǎn)物PmcsT（350 bp）。將PmcsT與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，由生工生物工程（上海）有限公司對轉(zhuǎn)化子進行序列測定。

2 結果與分析

2.1 asnA基因的啟動子PasnA和終止子TasnA的PCR擴增結果

圖1為啟動子PasnA和終止子TasnA的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，由圖1可知，兩片段分別位于158 bp和139 bp附近，表明擴增成功（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-PasnA和pMD18-T-TasnA的PCR擴增鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，片段大小與預期結果相符（圖2）。

2.6 重組質(zhì)粒pMD18-T-PmcsT的PCR鑒定結果

用提取的質(zhì)粒pMD18-T-PmcsT作為模板進行PCR擴增，可得到一條350 bp的DNA條帶（圖5），和預期結果相符。

3 討論

啟動子是一段供RNA聚合酶定位和促進DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，位于核糖體結合位點（RBS）上游10～100 bp處，由調(diào)節(jié)基因控制，是DNA分子上可以與RNA聚合酶特異性結合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。影響外源基因的表達有很多因素，如啟動子、內(nèi)含子和polyA等，其中啟動子的作用最為重要，它是基因工程表達載體的重要元件。理想的啟動子具有以下特性：作用強；可以嚴格調(diào)控；容易轉(zhuǎn)導進其他菌體中以便篩選陽性菌株，而且對其誘導是簡便和廉價的。本研究克隆的啟動子為巴氏桿菌的天冬酰氨合成酶A基因（asnA）的啟動子PasnA，該基因活性較強，在它的5′上游區(qū)具有比較典型的Pribnow盒，位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點-10 bp的位置有一段TATATATTTTAA序列，這是一段由連續(xù)12個A或T組成的序列，它們可以與RNA聚合酶相結合，這一序列的核苷酸結構在很大程度上決定了啟動子的強度。其SD序列是位于ATG上游8 bp處的富含嘌呤（AAGG）的核苷酸序列。本試驗克隆的啟動子活性很高，可以用來構建高效表達載體。據(jù)報道，天冬酰氨合成酶基因在感染雞后是非常強的上調(diào)基因，3只試驗雞體內(nèi)感染了巴氏桿菌后其mRNA產(chǎn)生量較體外分別提高了9.3、2.3和6.5倍[7]。據(jù)此，我們認為該啟動子是一個較好的用于巴氏桿菌在雞體內(nèi)表達外源基因的啟動子。

在原核生物中，轉(zhuǎn)錄終止有兩種不同的機制。一種是依賴六聚體蛋白質(zhì)rho的rho依賴性轉(zhuǎn)錄終止，rho蛋白質(zhì)能使新生RNA轉(zhuǎn)錄本從模板解離。另一種是rho非依賴性轉(zhuǎn)錄終止，它特異性依賴于模板上編碼的信號，即在新生RNA中形成發(fā)卡結構的回文序列區(qū)和位于該回文序列下游4～9 bp處的dA、dT富含區(qū)。雖然轉(zhuǎn)錄終止子在表達質(zhì)粒的構建過程中常被忽略，但有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達載體中必不可少的元件。貫穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能，造成所謂的啟動子封堵。這種效應可以通過在編碼序列下游的適當位置放置轉(zhuǎn)錄終止子，阻止轉(zhuǎn)錄過程。另有資料證明，由強啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄會使轉(zhuǎn)錄通讀到復制區(qū)，造成控制質(zhì)?？截悢?shù)的ROP蛋白質(zhì)的過量表達，從而導致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。因此，功能可靠的轉(zhuǎn)錄終止子能夠增強mRNA的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平[10]。本試驗克隆的禽巴氏桿菌天冬酰氨合成酶A基因的終止子TasnA的序列顯示，該序列中有一段很明顯且較長的回文序列：AAAAGTGCGGTGG…NN…CCACCGCACTTTT，位于該回文序列下游還有一段A/T富含區(qū)。這些現(xiàn)象表明TasnA屬于rho非依賴性轉(zhuǎn)錄終止子，可以有效終止轉(zhuǎn)錄。作為轉(zhuǎn)錄終止的信號和組成發(fā)卡結構的保護性元件，阻止核酸外切酶對mRNA的降解，從而延長mRNA的半衰期。

穿梭載體（Shuttle vector）是指在兩種宿主生物體內(nèi)復制和能在其中至少一個宿主生物體內(nèi)表達外源蛋白質(zhì)的載體分子，因而可以運載目的基因穿梭往返于兩種生物之間。穿梭質(zhì)粒載體一般由表達元件、兩種宿主生物體內(nèi)的復制原點，以及用于轉(zhuǎn)化菌篩選的抗性基因或報告基因等組成。表達元件包括啟動子-多克隆位點-轉(zhuǎn)錄終止信號等。本試驗構建的PmcsT是由PasnA（啟動子-核糖體結合位點區(qū)域）、mcs（多克隆位點區(qū)）和TasnA（終止區(qū)）3個片段組成的。其中PasnA是巴氏桿菌天冬酰氨合成酶A基因的強啟動子，它具有原核生物典型的結構特征，能被巴氏桿菌的RNA聚合酶所識別，其功能在后續(xù)的研究中已得到證實。pUC18的多克隆位點mcs具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。TasnA是巴氏桿菌天冬酰氨合成酶A基因的強終止子，具有很好的回文結構和位于發(fā)卡結構后面的一段A/T富含區(qū)。這一特點說明該終止子可以使RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，同時有效的終止子使得所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。endprint

PmcsT只是一個中間型載體，它不表現(xiàn)任何功能蛋白質(zhì)，是構建表達載體或穿梭載體的工具或平臺。在以后的工作中，可以根據(jù)需要，在PmcsT中加載目的基因并添加巴氏桿菌復制子或巴氏桿菌-大腸桿菌雙復制子，構建巴氏桿菌表達載體或巴氏桿菌-大腸桿菌穿梭載體。所以構建三聯(lián)體PmcsT是一項基礎性工作，為今后構建高效表達外源基因的巴氏桿菌活菌載體疫苗奠定了良好的基礎。

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