朱亞珠

（浙江國際海運職業(yè)技術學院，浙江舟山316021）

甘薯葉中咖啡酰奎尼酸類物質的分離純化和高效液相色譜法分析

朱亞珠

（浙江國際海運職業(yè)技術學院，浙江舟山316021）

以甘薯葉為研究材料，通過半制備高效液相色譜（HPLC）分離純化得到6種咖啡?？崴犷愇镔|產品，并采用核磁共振（NMR）和電噴霧飛行時間質譜（ESI-TOF/MS），對不同甘薯葉多酚的具體組成成分及多酚含量進行檢測分析。結果表明，甘薯葉多酚主要為咖啡酰奎尼酸及其衍生物。不同品種的甘薯葉多酚組成基本相同，主要成分為3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA，但含量有所差異。本實驗采用高效液相色譜法準確、重現(xiàn)性好，并結合對不同品種紫薯葉酚類物質含量進行比較，能夠為生產原料選擇和工藝提供質量控制依據。

甘薯葉，多酚，咖啡?？崴?，純化，高效液相色譜

甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam.］是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根作物，廣泛種植于世界各國［1］。目前有關甘薯營養(yǎng)價值的研究較多，日本已將其列為抗癌食品［2］。但是，對于甘薯莖葉研究卻遠不及對甘薯的研究深入?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，甘薯葉具有抗氧化，抗過敏，促進胃腸蠕動，刺激消化，治療便秘，促進膽固醇排泄，防止心血管脂肪沉積，維持動脈血管彈性，保護消化道、呼吸道及關節(jié)腔潤滑等功效［3-6］。我國，甘薯葉資源十分豐富，但目前基本上作為廢棄物被拋棄，若能變廢為寶，將甘薯葉進行深加工，具有十分重要的經濟價值和現(xiàn)實意義［7-8］。

隨著現(xiàn)代營養(yǎng)科學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)多酚類物質對人體有著重要的生理功能，具有很強的抗氧化效果。甘薯葉中含有大量的富含還原性酚羥基的多酚類物質，其活性成分及功能逐漸受到學者的關注［9-13］。目前國內外已有一些關于甘薯葉多酚組成分析的報道［14-15］，但很少涉及到不同品種甘薯葉間多酚含量及其成分的比較，阻礙了我國針對不同品種紫薯資源的深層次開發(fā)。本文采用半制備型HPLC從甘薯葉中分離純化甘薯葉多酚單體化合物，并利用HPLC對不同甘薯葉多酚的具體組成成分進行分析，以期為我國甘薯葉的開發(fā)利用提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

10份甘薯親本材料浙江省舟山市，2012年7月，葉齡5個月，由舟山市普陀區(qū)勾山富都生態(tài)農場提供（表1）；3-CQA（綠原酸，3-O-Caffeoylquinic acid，CAS號327-97-9，純度＞98%）購于美國Sigma公司；Folin-Ciocalteu試劑、4-咖啡奎寧酸（4-CQA，4-OCaffeoylquinic acid，CAS號905-99-7，純度＞98%）、5-咖啡奎寧酸（5-CQA，5-O-Caffeoylquinic acid，CAS號906-33-2，純度＞98%） 購于日本Fluka公司；3，4-咖啡奎寧酸（3，4-diCQA，3，4-di-O-caffeoylquinic acid）、3，5-咖啡奎寧酸（3，5-diCQA，3，5-di-O-caffeoylquinic acid）、4，5-咖啡奎寧酸（4，5-diCQA，4，5-di-O-caffeoylquinic acid）根據Liu等［16］的方法制備；甲醇、甲酸（色譜純）、無水乙醇等其他試劑（分析純） 購于南京化學試劑有限公司。

BL-220H分析天平日本島津公司；Agilent 1100高效液相色譜儀美國安捷倫公司；TSKgel ODS-80 TsQA色譜柱（4.6mm×250mm） 日本Tosoh公司；YMCPACK ODS-A色譜柱（10mm×250mm，5μm，） 日本YMC公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇國華電器有限公司；AKTA Purifier 10蛋白純化系統(tǒng)美國通用電氣公司；micrOTOF-QIII電噴霧飛行時間質譜儀（ESI-TOF/MS） 美國Applied Biosystems公司；Bruker DRX-500MHz核磁共振儀（NMR） 德國Bruker公司；MODULYOD-230冷凍干燥機美國。

表1　實驗所用甘薯主要育種親本及來源地Table 1　Names and origins of main sweet potato parents used in this study

1.2實驗方法

1.2.1樣品處理在甘薯大田封壟期，取5株甘薯植株的頂部展開葉，每株取2片，共取10片，冷凍后在冷凍干燥機內真空冷凍干燥24h，混合均勻，4℃保存。

1.2.2提取方法分別稱取10種甘薯葉粉末（甘薯葉用研缽充分搗碎），依據實驗室之前確定的甘薯葉多酚最佳提取工藝［16］：提取溫度80℃，料液比1∶50，乙醇濃度70%，提取40min，提取2次，得甘薯葉乙醇提取液。

1.2.3甘薯葉多酚單體化合物的分離純化及結構鑒定采用半制備型HPLC分離純化甘薯葉的酚類單體化合物。甘薯葉乙醇提取液經0.22μm微孔濾膜過濾后，采用AKTA純化系統(tǒng)制備各CQA單體［17］。色譜柱為YMC-PACK ODS-A色譜柱（10mm×250mm，5μm）；檢測波長為280nm；進樣量為500μL，每管收集5mL；洗脫條件為40%（v/v）甲醇，流速2.0mL/min。根據紫外檢測器的實時監(jiān)測收集洗脫液，多次上樣，將出峰時間相同的物質富集起來，濃縮并冷凍干燥，制備得到的化合物進行ESI-TOF/MS和NMR分析。

ESI-TOF/MS在Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra三重四級桿質譜儀上采用電噴霧離子源（ESI），在負離子模式下進行檢測，具體參數(shù)：干燥氣為N2，溫度270℃；干燥氣體積流量4L/min，壓力9psi；毛細管電壓4kV。

NMR在Bruker DRX-500核磁共振譜儀上以D2O為溶劑進行，采用5mm TXI H探頭，工作頻率為500MHz，在300K溫度下測定。

1.2.4甘薯葉多酚的組成分析甘薯葉多酚的組成分析采用HPLC法［16］。取甘薯葉乙醇提取液，用去離子水適當稀釋，0.22μm微孔濾膜過濾，濾液即為HPLC分析液。色譜條件：TSKgel ODS-80 TsQA色譜柱；柱溫40℃；進樣體積為20μL；采用梯度洗脫，流動相A為水，流動相B為甲醇，流動相C為5‰（v/v）甲酸溶液，流速為0.5mL/min，洗脫梯度如表2所示。根據保留時間和特征吸收色譜與3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA標準品對照定性，采用外標法定量。

表2　HPLC檢測的洗脫梯度Table 2　Scheme of elution gradient for HPLC analysis

1.2.5混合標準品溶液的制備精確稱取干燥至恒重的3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA標準品，分別制備濃度為0.1、0.05、0.01、0.005、0.0025g/L的系列混合標準液，進行HPLC檢測，以濃度（g/L）為x，以峰面積為y，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.6檢出限的測定在相同色譜條件下，測定不同質量濃度混合標準溶液。HPLC方法對標準品的檢出限是指不斷稀釋標樣溶液直至HPLC在280nm波長檢出的色譜峰信號（峰高）與噪音比在3∶1時所對應的標樣濃度，以不同濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標。

1.2.7精密度、穩(wěn)定性、重復性和加標回收率的測定精密度：移取混合對照品20μL，連續(xù)進樣6次，以峰面積計算相對標準偏差（RSD），考察儀器的精密度。

穩(wěn)定性：精密移取10μL制備得到的樣品溶液，2、4、8、16、32h各測定一次。

重復性：稱取同一產地同一品系紫薯葉粉末5份，按1.2.2制備溶液，精密移取20μL進樣。

加標回收率：精確稱取已知6種單體酚類含量的紫薯葉粉末7份，其中2份加入1.2.5中的混合對照品溶液0.1mL，2份加入稀釋10倍的混合對照品溶液0.2mL，2份加入稀釋10倍的混合對照品溶液0.1mL，1份留作空白。然后按照1.2.2提取方法制備試樣，在1.2.4的色譜條件進樣10μL。

1.2.8甘薯葉多酚含量的測定甘薯葉多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法［18-19］。取0.5mL樣品液（適當稀釋）與1.0mL的Folin-Ciocalteu試劑混勻，靜置5min，加入2.0mL飽和Na2CO3溶液，30℃水浴反應1h，冷卻后測定反應液在765nm波長處吸光度。甘薯葉多酚含量為每克甘薯葉原料中所含多酚的量（以綠原酸計，mg/g）。

1.2.9不同種甘薯葉多酚紫外掃描測定以不同品種的甘薯葉為材料，按1.2.4中的色譜條件對10種甘薯葉中多酚類物質的組成和含量進行分析、比較。

1.3數(shù)據分析

利用統(tǒng)計軟件SPSS對不同品系甘薯葉多酚總含量和酚類單體化合物的物質含量數(shù)據進行方差分析和LSD多重比較。

2　結果與分析

2.1甘薯葉多酚的HPLC分析

甘薯葉粉末用70%乙醇在80℃浸提40min，浸提2次，合并提取液。提取液經稀釋和0.22μm微孔濾膜過濾，按1.2.4進行HPLC分析。從圖1可見，采用TSKgel ODS-80 TsQA色譜柱和水-甲醇-甲酸（5‰，v/v）為流動相，分離效果好，峰形對稱。經與標樣保留時間及紫外全掃描圖譜比較，可以確定其中3-CQA、4-CQA、5-CQA分別對應化合物A、B、C，保留時間分別為14.21、21.46、22.06min；保留時間為31.34、33.02、38.89min的D、E、F色譜峰為未知成分。

2.2甘薯葉多酚單體成分的制備與結構解析

利用AKTA純化系統(tǒng)和YMC-PACK ODS-A色譜柱分別對甘薯葉多酚單體成分進行分離純化，收集各組分，經濃縮、冷凍干燥得到化合物1～6（圖2，濃度均為0.1g/L）?；衔?～6經HPLC分析，峰形清晰、單一，純度均在95%以上；化合物1～3經過與標樣保留時間及紫外全掃描圖譜比較，分別確定為3-CQA，4-CQA，5-CQA?；衔?～3的NMR分析如表3所示，同時3種化合物的LC-MS分析均為m/z 515［M-H］-。經NMR和ESI-TOF/MS分析，以及參照相關文獻［17，20-23］，得到化合物4～6分別為3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA。

圖1　甘薯葉多酚提取液的HPLC色譜圖Fig.1　HPLC-DAD chromatogram of polyphenols extract from sweet potato leaves

圖2　混合酚類標準品（0.1g/L）的HPLC色譜圖Fig.2　HPLC-DAD chromatogram of prepared standard solutions of polyphenolic compounds

表3　6種單體酚類物質標準曲線Table 3　Standard curves of 6 kinds of polyphenol monomers

2.3HPLC法測定甘薯葉多酚單體成分的含量

2.3.1甘薯葉多酚中單體的標準曲線與線性范圍精確移取1.2.5中的混合標準品1mL進行梯度稀釋，稀釋后標準品和1.2.2中的樣品溶液在1.2.4色譜條件下進樣20μL，3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA均能夠得到良好的分離。根據保留時間和色譜峰的比對，樣品中測得了6種對應的單體酚類物質，分別為3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA。酚類化合物回歸方程如表4所示，各對照品濃度與峰面積的相關性良好，R2＞0.999。

2.3.2分析方法的評價精密度：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA峰面積RSD分別為1.03%、0.82%、0.99%、1.21%、1.17%、0.79%，說明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA的峰面積的RSD分別為0.97%、0.99%、1.21%、1.51%、1.14%、0.87%，表明待測液中的6種多酚成分在32h內穩(wěn)定性良好。

重復性：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA的峰面積的RSD分別為0.88%、0.75%、1.67%、1.82%、1.42%、0.97%，方法重現(xiàn)性良好。

加標回收率：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA的回收率分別為99.87%、99.47%、99.62%、99.80%、99.77%、99.91%，RSD分別為0.68%、0.79%、1.55%、1.43%、1.48%、0.94%，說明本方法可行。

2.3.3不同種甘薯葉多酚紫外掃描分析甘薯葉多酚的HPLC分析結果如圖1所示，有6種組成成分。紫外掃描結果如圖3所示，表明，峰A、B、C、D、E、F均在326nm處有最大吸收，同時在296nm處有一肩峰。結合甘薯葉HPLC分析結果以及紫外掃描結果，判斷甘薯葉多酚物質主要為咖啡酰奎尼酸類物質，組分峰A、B、C、D、E、F分別為3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA。這與國外的研究結果基本一致［20-23］。同時，結果表明不同品種甘薯葉的咖啡酰奎尼酸類物質組成相同，但各咖啡?？崴犷愇镔|的含量有差異（表5）。

表4　6種單體酚類物質標準曲線Table 4　Standard curves of 6 kinds of polyphenol monomers

表5　甘薯葉中咖啡?？崴犷愇镔|的含量Table 5　Caffeoylquinic acid concentrations in sweet potato leaves

2.4不同種甘薯葉多酚含量分析

采用Folin-Ciocalteu法，對10種不同品種甘薯葉乙醇提取物的多酚含量進行分析、比較，不同品種甘薯葉乙醇提取物的多酚含量具體見表6。實驗發(fā)現(xiàn)，不同甘薯葉品系間多酚含量差異顯著（p＜0.05），變化范圍為41.52～182.86mg/g，其中臺農71最高，煙薯27含量最低。本實驗是在同田條件下種植不同甘薯品系，其多酚種類和含量均有差異。據此認為，甘薯中多酚含量和組成不僅與環(huán)境有關，也可能由其遺傳背景所決定［21］。

表6　不同品種甘薯葉的多酚含量Table 6　Total polyphenol content of different varieties of sweet potato leaves

3　結論

根據前人對甘薯葉中化學成分的研究，甘薯葉多酚為一類由奎尼酸和不同數(shù)目的咖啡酸縮合而成的酚酸類化合物［21］。根據甘薯葉中咖啡酰奎尼酸類化合物特性的不同，本實驗采用半制備型HPLC從甘薯葉中分離純化得到6種咖啡?？崴釂误w，即3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA。該方法簡便易行，分離效果良好，純化率高，可用于高純度咖啡酰奎尼酸類物質類單體的制備。同時，本實驗以甲醇和甲酸為流動相進行梯度洗脫，采用HPLC-DAD和TSKgel ODS-80 TsQA色譜柱，建立了一種快速檢測和分析甘薯葉中咖啡?？崴犷愇镔|的HPLC方法，具有穩(wěn)定性高、重復性好的優(yōu)點，并有望用于不同種類甘薯葉的初步鑒定。

圖3　峰A～F的紫外掃描譜圖Fig.3　The UV spectra of peak A～F

本實驗發(fā)現(xiàn)，甘薯葉中酚類單體主要為咖啡?？崴犷惢衔铮渲?，5-diCQA的含量最高。此外，不同酚類單體在不同品系中含量也不相同，說明甘薯中的多酚含量和組成不僅受環(huán)境影響，也與其遺傳背景有一定的聯(lián)系，這為選育不同類型優(yōu)良甘薯品系提供了依據。

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Purification of caffeoylquinic acids from sweet potato leaves and their analysis by high performance liquid chromatography

ZHU Ya-zhu
（Zhejiang International Martime College，Zhoushan 316021，China）

Six caffeoylquinic acid（CQA）derivatives were separated by semi-preparative high performance liquid chromatography（HPLC）from sweet potato leaves.The structures of prepared monomers were confirmed by 1H NMR and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry（ESI-TOF-MS），and the components and total polyphenol contents of different sweet potato leaves were analyzed.The results demonstrated that sweet potato leaf polyphenols were mainly caffeoylquinic acid and its derivatives.The composition of different varieties of sweet potato leaves were basically the same，the main component were six CQA derivatives，including 3-CQA，4-CQA，5-CQA，3，4-diCQA，3，5-diCQA and 4，5-diCQA，and the contents of total polyphenol were different in various groups.Overall，this HPLC method was accurate for investigation of the polyphenol contents and components in sweet potato leaves，and lay down a base for the choice of production material.

sweet potato leaves；polyphenols；caffeoylquinic acids；purification；HPLC

TS201.2

A

1002-0306（2015）10-0073-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.006

2014－07－21

朱亞珠（1962-），女，碩士研究生，副教授，主要從事食品加工工藝方面的研究。

浙江省科技廳公益技術應用研究項目（2011C33014）。