俞勝琴

（江寧區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 211100）

不同加樣方式對(duì)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)乙肝核心抗體的影響

俞勝琴

（江寧區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 211100）

目的 探討不同加樣方式對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)乙肝核心抗體結(jié)果的影響。方法 收集132例門診和住院患者血清樣本，運(yùn)用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法，按照3種不同的加樣方式檢測(cè)乙肝核心抗體進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果 加樣方式1的陽(yáng)性率為12.12%；加樣方式2的陽(yáng)性率為14.39%；加樣方式3的陽(yáng)性率為28.78%。三種不同的加樣方式，陽(yáng)性檢出率各不相同。結(jié)論 三種不同的加樣方式對(duì)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)乙肝核心抗體的檢測(cè)結(jié)果不同。加樣方式1是標(biāo)準(zhǔn)的加樣方式，準(zhǔn)確性高；加樣方式2與加樣方式1相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果無(wú)明顯差異；加樣方式3與加樣方式1相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果有明顯差異。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；競(jìng)爭(zhēng)法；乙肝核心抗體；陽(yáng)性檢出率

乙型肝炎核心抗體是乙肝病毒感染的指標(biāo)，它的出現(xiàn)提示機(jī)體正在感染或既往感染過(guò)乙肝病毒。因此，乙肝核心抗體的檢測(cè)在乙型肝炎的診治方面具有十分重要的作用[1-2]。ELISA法檢測(cè)乙肝病毒核心抗體已成為應(yīng)用最廣泛的免疫檢測(cè)技術(shù)。ELISA競(jìng)爭(zhēng)法是檢測(cè)乙肝病毒核心抗體的常用方法，在臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用。本文運(yùn)用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)132例門診及住院患者乙肝核心抗體為例，以不同的加樣方式對(duì)ELISA競(jìng)爭(zhēng)法的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)，分析其對(duì)乙肝核心抗體陽(yáng)性檢出率的差異。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本：隨機(jī)抽取2014年4～6月，132例門診和住院患者血清樣本，清晨空腹采集患者的靜脈血5 mL，患者年齡段為22～50歲，平均38歲；標(biāo)本無(wú)溶血、脂血、黃疸等。

1.2試劑及儀器：核心抗體ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)家由北京萬(wàn)泰藥業(yè)股份有限公司提供，酶標(biāo)儀（KHB KT-360）和洗板機(jī)（KHB KT-36W）均由上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1采血2 h后，離心分離血清，2～8 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)完成測(cè)試。

1.3.2加樣方式1：用可調(diào)加樣器調(diào)至100 μL，吸取100 μL血清放入試管底部，用吸管取0.9%氯化鈉3 mL混勻（1∶30倍稀釋）。每板設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔，空白對(duì)照1孔，微孔按序編號(hào)。分別在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品及陰、陽(yáng)對(duì)照各50 μL，空拍孔不加；加樣方式2：血清不稀釋，每孔直接加入血清10 μL，各設(shè)陰、陽(yáng)及空白對(duì)照；加樣方式3：血清不稀釋，每孔直接加入血清50 μL，各設(shè)陰、陽(yáng)及空白對(duì)照[3]。

1.3.3加酶：每孔均加入酶標(biāo)試劑50 μL，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置37 ℃，溫育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干[4]。每孔加入顯色劑A、B液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處，用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測(cè)定各孔A值。

1.3.4統(tǒng)計(jì)：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，通過(guò)χ2檢驗(yàn)，P＞0.01，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果：“加樣方式1的陽(yáng)性率為12.12%；加樣方式2的陽(yáng)性率為14.39%；加樣方式3的陽(yáng)性率為28.78%?！?/p>

2.2三種不同加樣方式檢測(cè)132例乙肝核心抗體結(jié)果分析：見表1、2。

表1　方法2與方法1檢測(cè)乙肝核抗體結(jié)果比較

表2　方法3與方法1檢測(cè)乙肝核抗體結(jié)果比較

3　討 論

ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法的原理，是將抗原包被反應(yīng)板，加入待檢標(biāo)本與酶標(biāo)液的單克隆抗體二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原，即酶標(biāo)抗體和標(biāo)本抗體在同樣的反應(yīng)體系中與固相抗原等比競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，溫育后洗滌加入顯色劑，顯色的強(qiáng)弱與待檢標(biāo)本中抗體的含量成反比[5]。ELISA競(jìng)爭(zhēng)法是檢測(cè)乙肝核心抗體實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、實(shí)用、實(shí)驗(yàn)要求條件低、易于操作，是被臨床廣泛應(yīng)用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)明：

3.1三種不同的加樣方式運(yùn)用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法的原理對(duì)乙肝病毒核心抗體進(jìn)行檢測(cè)，加樣方式不同，檢出的陽(yáng)性率也有差異。

3.2加樣方式1操作流程較復(fù)雜，血清標(biāo)本要經(jīng)過(guò)1∶30倍的稀釋。稀釋時(shí)，每人需要一支試管，當(dāng)樣本量大時(shí)，會(huì)造成一定的人力、物力的浪費(fèi)。但此加樣方式準(zhǔn)確性高，臨床可靠，是標(biāo)準(zhǔn)的加樣方式，公認(rèn)的檢測(cè)方法。

3.3加樣方式2是直接加入血清10 μL，其加樣方式和標(biāo)準(zhǔn)加樣方式1二者檢測(cè)的結(jié)果，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與比較：χ2=0.16，0.5＜P＜0.75，P＞α=0.05，乙肝病毒核心抗體陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，變化不顯著。此法雖不是標(biāo)準(zhǔn)的加樣方式，當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模的體檢時(shí)，即檢測(cè)的樣本量很大時(shí)，運(yùn)用此法，省去了加樣方式1的血清標(biāo)本1∶30倍稀釋的繁瑣程序，在一定程度上具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的特點(diǎn)，提高了工作效率。

3.4加樣方式3是直接加入血清50 μL。實(shí)驗(yàn)表明，與標(biāo)準(zhǔn)的加樣方式1相比較：χ2=11，P＜0.005，P＜α=0.05。兩方法的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，乙肝病毒核心抗體的陽(yáng)性率明顯上升，差異顯著。導(dǎo)致此結(jié)果可能是以下幾個(gè)方面的原因：①當(dāng)直接加入50μL血清標(biāo)本時(shí)，乙肝病毒核心抗體的酶標(biāo)抗體-HBc與反應(yīng)板上包被的固相抗原HBcAg結(jié)合機(jī)會(huì)有所減少，從而嚴(yán)重影響結(jié)果的檢測(cè)；②抗原與抗體的特異性結(jié)合，是有一定的比例性，當(dāng)比例不匹配時(shí)，會(huì)出現(xiàn)帶現(xiàn)象。即抗體過(guò)量時(shí)，出現(xiàn)前帶現(xiàn)象；抗原過(guò)量時(shí)，出現(xiàn)后帶現(xiàn)象。本試驗(yàn)，是由于加入了過(guò)量的抗體，故出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象；③有研究報(bào)道未稀釋或低倍稀釋存在較高的非特異反應(yīng)；單項(xiàng)乙肝病毒核心抗體陽(yáng)性標(biāo)本中存在低滴變和假陽(yáng)性結(jié)果[6]。由于上述原因常常會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)，使得陽(yáng)性率明顯增高。所以，加樣方式3不適合用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法檢測(cè)乙肝病毒核心抗體標(biāo)志物。

3.5當(dāng)然，影響ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法的因素還有很多很多。在日常的實(shí)際操作中，除上述加樣方式外，還有加樣的間隔時(shí)間長(zhǎng)短[7]、標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)間過(guò)長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不完全、試劑盒的抗原不純等等都可導(dǎo)致假陽(yáng)性，影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-9]。

因此，在ELISA法驗(yàn)測(cè)乙肝病毒核心抗體標(biāo)志物時(shí)，若一般門診及住院患者數(shù)量不是很大時(shí)建議采用加樣方式1；遇有大規(guī)模普查或體檢情況等大量標(biāo)本時(shí)若采用加樣方式1，其工作量太大，同時(shí)也增加了操作的繁瑣性，建議采用加樣方式2；原則上在ELISA法檢測(cè)乙肝病毒核心抗體時(shí)，不采取加樣方式3的方式。同時(shí)，我們?cè)趯?shí)際操作過(guò)程中，還應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格處理，選擇靈敏度高、特異性強(qiáng)的試劑和具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定的酶標(biāo)儀，開展室內(nèi)質(zhì)控等辦法與舉措，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，更好地為患者及臨床服務(wù)[10]。

[1] 張麗莉,蔡安.三種不同加樣模式對(duì)ELISA法檢測(cè)乙型肝炎核心抗體結(jié)果的影響[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2010,28(6):645.

[2] 胡建平.不同加樣方式對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗-HBc的影響[J].臨床誤診誤治,2011,24(6):81-82.

[3] 梁修珍.6種不同加樣量對(duì)酶聯(lián)免疫測(cè)定法檢測(cè)乙型肝炎病毒核心抗體結(jié)果的影響[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(4):481-482.

[4] 鄒映東,林云,張興宗,等.不同稀釋及洗板方式對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)乙肝核心抗體的影響[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(12):1569-1570.

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[8] 楊京民.ELISA法對(duì)乙型肝炎“兩對(duì)半”檢測(cè)結(jié)果的影響因素的分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,32(21):2551-2552.

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1671-8194（2015）30-0145-02