龔晶婧 盧卓強(qiáng) 許昌聲 王華軍 晉學(xué)慶*

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005）

厄貝沙坦抑制大鼠平滑肌細(xì)胞AT1R及其下游信號(hào)通路

龔晶婧 盧卓強(qiáng) 許昌聲 王華軍 晉學(xué)慶*

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005）

目的 本研究目的是利用厄貝沙坦、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）干預(yù)平滑肌細(xì)胞，闡明血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）對(duì)血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）表達(dá)及其下游信號(hào)通路的影響。方法 利用Western Blot技術(shù)，研究厄貝沙坦、血管緊張素Ⅱ干預(yù)平滑肌細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞AT1受體蛋白表達(dá)及其下游信號(hào)通路-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）蛋白磷酸化水平的影響。結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦能顯著地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體蛋白表達(dá)（ 0.208±0.022 vs 0.997±0.131，P<0.01）及下游信號(hào)通路中的ERK1/2蛋白磷酸化（0.055±0.007 vs 0.103±0.020，P<0.01）、STAT3蛋白磷酸化（0.162±0.010 vs 0.758±0.054，P<0.01）。結(jié)論 這些研究結(jié)果表明厄貝沙坦抑制AT1R和下游的ERK1/2及STAT3信號(hào)通路，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖等，發(fā)揮控制血壓、防治心腦血管疾病作用。

厄貝沙坦；血管緊張素Ⅱ1型受體；ERK1/2；STAT3

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在人體內(nèi)涉及多器官、多系統(tǒng)，是一種重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)和循環(huán)通路。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是RAS系統(tǒng)中一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)控物質(zhì)，是由一種重要代謝酶即血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）轉(zhuǎn)換血管緊張素1產(chǎn)生的。AngⅡ作用于AT1受體，主要的生理作用是引起血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移和細(xì)胞肥大、血管收縮、內(nèi)皮損傷、組織重構(gòu)、炎性因子表達(dá)和促進(jìn)氧化應(yīng)激等生物學(xué)效應(yīng)[1-2]。目前血管緊張素Ⅱ受體特異性抑制劑（ARB）主要作用于腎素-血管緊張素- 醛固酮系統(tǒng)，能有效地控制血壓，改善心功能，提高患者的運(yùn)動(dòng)耐受時(shí)間并顯著改善癥狀等，在臨床上已成為治療高血壓及心血管疾病，減少心腦血管事件及腎功能障礙發(fā)生的一線藥物之一[3]。

對(duì)AT1 R研究已經(jīng)證明，血管緊張素Ⅱ的生物作用，大部分是通過(guò)與AT1R結(jié)合后實(shí)現(xiàn)的[4-5]。AT1受體調(diào)控主要是通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38-絲裂原活化蛋白激酶（p38- MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等來(lái)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增生、遷移、黏附等。

本研究主要通過(guò)血管緊張素Ⅱ受體特異性抑制劑（ARB）類藥物厄貝沙坦干預(yù)平滑肌細(xì)胞，研究厄貝沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體蛋白及下游信號(hào)通路中的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平的影響，探討ARB類藥物拮抗AngⅡ的生物學(xué)作用，從而進(jìn)一步研究其防治心腦血管疾病的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要材料：體質(zhì)量為120～130 g普通SD成年大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，AngⅡ購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），厄貝沙坦：揚(yáng)子江藥業(yè)惠贈(zèng)，TRIZOL試劑：購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），兔抗大鼠AT1R一抗（英國(guó)Abcam公司），兔抗大鼠P-STAT3、STAT3一抗（美國(guó)CST公司），兔抗大鼠P-ERK1/2、ERK1/2一抗（美國(guó)CST公司），小鼠β-actin一抗、羊抗大鼠和小鼠二抗（美國(guó)Santa Cruz公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）。

1.2SD大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（VSMC）的培養(yǎng)。SD大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（VSMC）的培養(yǎng)：采用組織貼塊法培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組僅用DMEM（2000 mg/L D-葡萄糖、非必需氨基酸、110 mg/L丙酮酸鈉、1.5 g/L碳酸氫鈉、25 mmol/L HEPES和L-谷氨酰胺培養(yǎng)基，pH 7.4）；AngⅡ干預(yù)組的終濃度分別為10-7mol/L，各組干預(yù)VSMC細(xì)胞8 h。厄貝沙坦干預(yù)濃度為10-7mol/L，在Ang Ⅱ干預(yù)前0.5 h 加入。細(xì)胞分組：①空白對(duì)照組。②AngⅡ組。③AngⅡ+厄貝沙坦組。④厄貝沙坦組。

1.4Western Blot檢測(cè)AT1R蛋白表達(dá)和ERK1/2及STAT3蛋白磷酸化水平：將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板上，分別將Ang Ⅱ和厄貝沙坦按上述最適濃度干預(yù)VSMCs完成后，在每孔中加入200 μL RIPA（組成：50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS），提取蛋白。10%的SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5% 的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗大鼠AT1R（1∶800），兔抗大鼠P-ERK1/2、ERK1/2（1∶800），兔抗大鼠P-STAT3、STAT3（1∶800），4 ℃ 過(guò)夜，用TBST（組成：1M Tris-HCl 10 mL pH 7.4，NaCl 8.8 g，吐溫200.05%）洗3次，每次10 min。加入二抗（1∶1500），室溫培育1 h，TBST洗3次，每次10 min。顯色、曝光，經(jīng)Guantity onel軟件分析A值，并與內(nèi)參照的比值作為半定量指標(biāo)進(jìn)行比較。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每個(gè)樣本采用復(fù)孔，重復(fù)4次。所得數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件系統(tǒng)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間指標(biāo)的均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1厄貝沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC 后AT1受體蛋白表達(dá)水平的影響：Western-Blot檢測(cè)VSMC中AT1受體蛋白的表達(dá)。我們觀察到：與空白對(duì)照組相比，AngⅡ干預(yù)VSMC后AT1受體蛋白的表達(dá)明顯增加（0.731±0.079 vs 0.997±0.131，P<0.01）。厄貝沙坦干預(yù)VSMC后能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體蛋白的表達(dá)，較AngⅡ組明顯減少（0.208±0.022 vs 0.997±0.131，P<0.01）。另外厄貝沙坦組的AT1受體蛋白表達(dá)水平同樣較空白組減少（0.093±0.011 vs 0.731±0.079，P<0.01）。上述結(jié)果說(shuō)明厄貝沙坦干預(yù)平滑肌細(xì)胞后明顯抑制Ang Ⅱ?qū)T1受體的刺激作用。見(jiàn)圖1。

圖1　顯示W(wǎng)estern blot檢測(cè)不同干預(yù)組平滑肌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)，結(jié)果表明：AngⅡ增加AT1受體蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比P<0.01。厄貝沙坦干預(yù)能明顯減少AngⅡ 誘導(dǎo)的VSMC AT1受體蛋白的表達(dá)，與Ang Ⅱ 組對(duì)比P<0.01（n=4）（*P<0.01 vs 空白對(duì)照組 ，# P<0.01，vs AngⅡ組 a：空白對(duì)照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄貝沙坦；d：厄貝沙坦AnⅡ：血管緊張素Ⅱ ； AT1R：血管緊張素Ⅱ 1型受體

2.2厄貝沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC后ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響：Western-Blot檢測(cè)VSMC中STAT3蛋白磷酸化水平。我們觀察到：與空白對(duì)照組相比，AngⅡ干預(yù)VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加（0.062±0.008 vs 0.103±0.020，P<0.01）。厄貝沙坦干預(yù)VSMC后明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2蛋白磷酸化，較AngⅡ組明顯減少（0.055 ±0.007 vs 0.103±0.020，P<0.01）。另外厄貝沙坦組的ERK1/2蛋白磷酸化水平同樣較空白組減少（0.026±0.006 vs 0.062±0.008，P<0.01）。以上結(jié)果表明厄貝沙坦明顯抑制Ang Ⅱ 刺激AT1受體介導(dǎo)的信號(hào)通路ERK1/2的磷酸化。見(jiàn)圖2。

2.3厄貝沙坦對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平的影響：Western-Blot檢測(cè)VSMC中STAT3蛋白磷酸化水平。我們觀察到：與空白對(duì)照組相比，AngⅡ干預(yù)VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平明顯增加（0.318±0.059 vs 0.758±0.054，P<0.01）。厄貝沙坦干預(yù)VSMC后明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的STAT3蛋白磷酸化，較AngⅡ組明顯減少（0.162±0.010 vs 0.758±0.054，P<0.01）。另外厄貝沙坦組的STAT3蛋白磷酸化水平同樣較空白組減少（0.081±0.031 vs 0.318±0.059，P<0.01）。以上結(jié)果表明厄貝沙坦明顯抑制AngⅡ 刺激AT1受體介導(dǎo)的信號(hào)通路STAT3的磷酸化。見(jiàn)圖3。

圖2　顯示W(wǎng)estern blot檢測(cè)不同干預(yù)組平滑肌細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平，結(jié)果表明：AngⅡ增加ERK1/2蛋白的磷酸化，與對(duì)照組相比P<0.05。厄貝沙坦干預(yù)后能明顯減少Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的ERK1/2蛋白的磷酸化，與AngⅡ 組對(duì)比P<0.01（n=4）（* P<0.01vs空白對(duì)照組，# P<0.01vs AngⅡ組a：空白對(duì)照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄貝沙坦；d：厄貝沙坦 ERK1/2：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2；T：total；P：phosphorylation

圖3　顯示W(wǎng)estern blot檢測(cè)不同干預(yù)組平滑肌細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化水平，結(jié)果表明：AngⅡ增加STAT3蛋白的磷酸化，與對(duì)照組相比P<0.05。厄貝沙坦干預(yù)后能明顯減少AngⅡ誘導(dǎo)的STAT3蛋白的磷酸化，與Ang Ⅱ 組對(duì)比P<0.01（n=4）（* P<0.01vs空白對(duì)照組，# P<0.01 vs AngⅡ組 a：空白對(duì)照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄貝沙坦；d：厄貝沙坦 STAT3：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3；T：total；P：phosphorylation

3　討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的AT1受體蛋白表達(dá)和AT1下游信號(hào)通路ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平，而ARB類藥物厄貝沙坦干預(yù)平滑肌細(xì)胞后，能明顯地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體蛋白表達(dá)和ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

AngⅡ的生物作用，主要是通過(guò)與AngⅡ特異性1型受體（AT1R）結(jié)合后實(shí)現(xiàn)的[5-9]。大量研究表明AT1受體調(diào)控主要是通過(guò)ERK1/2、p38、JNK來(lái)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖、黏附。近年來(lái)也有少量報(bào)道表明，JAK2、IRS-1的磷酸化也參與AT1受體調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、黏附[10-11]。ARB類藥物可在受體水平上高選擇、高效地阻斷AngⅡ與AT1 受體的結(jié)合，導(dǎo)致血管平滑肌收縮、醛固酮分泌增加，能有效地阻斷AngⅡ的水鈉潴留、血管收縮與組織重構(gòu)作用，從而阻斷AngⅡ介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。何松堅(jiān)等通過(guò)檢測(cè)2 型糖尿病大鼠血清AT1受體自身抗體證明厄貝沙坦聯(lián)合缺血后適應(yīng)可明顯減輕2 型糖尿病大鼠缺血再灌注后AT1R的表達(dá)，從而可能抑制早期心肌及間質(zhì)纖維化的發(fā)生，抑制早ARB類藥物具有控制血壓、減輕心肌肥厚、改善早期心肌纖維化、減輕早期心室重構(gòu)、改善預(yù)后的作用。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AngⅡ、AT1R 的水平有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦能明顯地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的AT1R 蛋白水平以及AT1下游信號(hào)通路上的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平。目前國(guó)內(nèi)外也有類似的研究報(bào)道。Moreno 等研究發(fā)現(xiàn)，AT1受體阻滯劑厄貝沙坦能夠通過(guò)抑制異源表達(dá)的KCNQ1/ KCNE1 通道電流[14]，阻滯AT1受體產(chǎn)生，起到治療房顫作用，提示ARB類藥物治療房顫的機(jī)制不但涉及心臟組織再建，同時(shí)也影響心臟電生理再建。周希等研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦通過(guò)AT1R經(jīng)ERK 信號(hào)途徑影響高血壓大鼠纖溶系統(tǒng)的活性[15]。Benkirane等研究證實(shí)替米沙坦可以抑制AngⅡ經(jīng)AT1R 介導(dǎo)的ERK 信號(hào)通路激活，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的增殖和物質(zhì)合成[16]。另外，替米沙坦亦可通過(guò)AT1R 作用經(jīng)ERK 信號(hào)通路調(diào)控纖溶活性從而改善大鼠心肌梗死后的纖溶系統(tǒng)功能[17]。

期心室重構(gòu)[12]。王亞萍等研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦可通過(guò)減少腎周脂肪堆積，抑制其局部RAAS，改善肥胖相關(guān)的血壓異常[13]。

綜上所述，ARB類藥物厄貝沙坦能通過(guò)下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體蛋白及下游信號(hào)通路中的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化從而拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的生物學(xué)作用，減輕細(xì)胞炎癥及增殖等，最終抑制血管收縮、血壓升高、心肌重構(gòu)、血管斑塊不穩(wěn)定方面等病理改變，發(fā)揮預(yù)防及治療心腦血管疾病的生理作用。

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Irbesartan Inhibits the AT1 Receptor -ERK1/2 and STAT3 Signal Pathway in Smooth Muscle Cells

GONG Jing-jing, LU Zhou-qiang, XU Chang-sheng, WANG Hua-jun, JIN Xue-qing
（The First Affiliated Hospital， Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China）

Objective To explore the effects of the angiotensintype1-receptor blockers (ARB) on the expression of angiotnsin Ⅱ type 1 receptor. Methods Irbesartan was added into cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs). Angiotensin Ⅱ type 1 (AT1) recetpor protein expression were detected with western blot, at the same time, the signalling pathway of (extracellular signal-regulated kinase 1/2)ERK1/2 and (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) STAT3 AT1 receptor actived were also detected. Results It was found that Irbesartan inhibit significantly AT1 receptor protein expression，not only in the absence , but also in the presence of AngⅡ. Similar to AT1 receptor protein expression, the signal ERK1/2 and STAT3 phosphorylation was obviously inhibited while Irbesartan intervention. Conclusion This study data show that Irbesartan was able to inhibit AT1 receptor expression and signal pathway of ERK1/2 and STAT3 phosphorylation.

Irbesartan; AT1R; ERK1/2; STAT3

R54

B

1671-8194（2015）30-0028-03