劉小玉 付登強(qiáng) 陳良秋 楊偉波 李東霞 符海泉

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所 油茶研究中心，文昌 571339）

油茶根際溶磷菌的分離、鑒定及溶磷能力研究

劉小玉 付登強(qiáng) 陳良秋 楊偉波 李東霞 符海泉

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所 油茶研究中心，文昌 571339）

采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)法，對油茶根際溶磷細(xì)菌進(jìn)行了分離，共篩選得到17株溶磷細(xì)菌。利用透明圈法對油茶根際土壤中具有溶磷能力的細(xì)菌進(jìn)行初篩；采用鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液的可溶性磷含量，對解磷菌株進(jìn)行復(fù)篩，得出菌株6-Y-09溶磷活性最強(qiáng)。根據(jù)進(jìn)行菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株 6-Y-09為洋蔥伯克霍爾德菌。該菌株在后續(xù)微生物菌肥研制中具有較大潛力，為通過生物途徑改善油茶磷素供應(yīng)，促進(jìn)油茶生長提供了優(yōu)良的菌株資源。

油茶根際；溶磷菌；分離和鑒定； 洋蔥伯克霍爾德菌

磷是植物生長發(fā)育的必需元素之一，但土壤中95%以上的磷與Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金屬離子結(jié)合而喪失植物有效性，植物難以吸收利用。如何提高土壤磷素利用率，分離篩選出高效且具有溶磷作用的微生物菌株并制成土壤磷素活化劑，已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。土壤中存在大量的微生物，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，具有這種能力的微生物稱為溶磷菌［1］，包括細(xì)菌、真菌和放線菌，廣泛分布在根際、土壤和作物種子表面［2］。溶磷菌除了溶解土壤中難溶性或不溶性的磷素外，還可以吸附根系周圍鋅、銅、鈣等微量元素，改善植物營養(yǎng)，同時(shí)分泌生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)根系生長等作用。因此應(yīng)用溶磷菌能夠有效地提高農(nóng)作物產(chǎn)量，對實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論和實(shí)踐意義［3］。

油茶屬山茶科常綠灌木或小喬木，是我國南方特有的木本油料作物。在耕地資源有限的情況下，努力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)對提升我國食用油自給率，保障國家食用油安全和提高山區(qū)農(nóng)民收入具有重要意義。海南油茶林土壤全磷含量范圍為100-120 mg/Kg，油茶在此范圍內(nèi)均可正常生長［4，5］，低磷條件下未表現(xiàn)出明顯的缺磷癥狀，近年來的研究結(jié)果表明油茶根際土壤中存在溶磷菌［6，7］，油茶根際溶磷菌的高效溶磷作用可能是油茶適應(yīng)低磷脅迫的重要機(jī)理之一。本實(shí)驗(yàn)通過對油茶根際溶磷菌的溶磷能力進(jìn)行研究，以期篩選出優(yōu)良溶磷菌株，為油茶產(chǎn)量的提高和微生物肥料研制提供理論依據(jù)，也為解決熱帶缺磷問題提供一條綠色途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試土壤采自五指山市油茶林地，采集健康的油茶植株根際土壤，將各樣品做好標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室置于4℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆小?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，MgS04·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO35.0 g，酵母膏0.4 g，瓊脂20g，蒸餾水1000 mL，pH7.0-7.5。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2-7.4。

1.2 方法

1.2.1 溶磷細(xì)菌的分離純化 稱取10 g根際土壤置于盛有90 ml無菌水的三角瓶中，振蕩30 min（160 r/min），制成懸浮液。取其上清液用無菌水10倍逐級稀釋，依次稀釋成10-2、10-3、10-4濃度，各吸取0.1 mL涂布于有機(jī)磷培養(yǎng)基平板，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取具有溶磷菌特征的單菌落劃線純化，并將純化的菌株接種到斜面LB培養(yǎng)基上，置于4℃的冰箱中保存待用。

1.2.2 溶磷細(xì)菌的溶磷能力

1.2.2.1 定性測定 采用溶磷圈法［8］，將培養(yǎng)基制成平板、分區(qū)，每區(qū)點(diǎn)植1個(gè)菌株，28℃培養(yǎng)7 d，觀察有無溶磷圈生成，測定溶磷圈直徑（D），菌落直徑（d）。根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈判斷菌株有無溶磷能力；根據(jù)D/d值大小初步確定菌株的溶磷能力，同時(shí)觀察并記錄菌落的性狀、大小、邊緣結(jié)構(gòu)、高度、透明度、顏色、生長狀況等。

1.2.2.2 定量測定 采用鉬銻抗比色法，于150 mL三角瓶中盛入有機(jī)磷液體培養(yǎng)基50 mL高壓滅菌20 min（121℃、101 kPa）備有。挑選各初篩菌株，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液變渾濁后離心，用無菌水重懸，即制備成菌懸液。分別將1 mL菌懸浮液接種于有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，30℃震蕩培養(yǎng)7 d（160 r/min）；培養(yǎng)完畢，發(fā)酵液于4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，采用鉬銻抗比色法測定有效磷增量（mg/L）［9］，計(jì)算公式如下：

P=K×V/V1

其中：P為有效磷增量；K為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得顯色液的磷含量（mg/L）；V為顯色時(shí)溶液定容的體積（mL）；V1為顯色時(shí)吸取上清液的體積（mL）［10］。

1.2.3 溶磷菌株培養(yǎng)液pH值變化測定 用酸度計(jì)測定培養(yǎng)7 d后的各菌株培養(yǎng)液pH 變化情況。

1.2.4 溶磷菌株6-Y-09的鑒定

1.2.4.1 菌株6-Y-09形態(tài)特征和主要生理生化特征 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［11］對菌株6-Y-09的菌落形態(tài)特征及主要生理生化特征進(jìn)行試驗(yàn)和觀察記錄。

1.2.4.2 菌株6-Y-09的16S rDNA序列分析 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取溶磷菌的DNA。PCR擴(kuò)增選用通用引物27 F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492 R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反應(yīng)體系50 μL（1 μL 模板、1 μL 1492 R、1 μL 27 F、25 μL PCR mastermix、22 μL ddH2O）。PCR 擴(kuò)增（94℃預(yù)變性5 min，94℃ 變性1 min，55℃ 退火1 min，72℃ 延伸1.5 min，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，72℃ 終延伸10 min，4℃保存），取50 μL PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在紫外燈下觀察、并拍照保存。將PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

經(jīng)測序獲得溶磷菌株6-Y-09的16S rDNA序列，將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（Neighbour-joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel和SAS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 溶磷細(xì)菌的分離純化

從油茶根際土壤樣品中共分離篩選獲得17株能產(chǎn)生明顯溶磷圈的細(xì)菌，對所分離純化得到的17株細(xì)菌的形態(tài)進(jìn)行觀察，并用溶磷圈法對各菌株的D/d值進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示。其中菌株6-Y-09在以卵磷脂為磷源的培養(yǎng)基上出現(xiàn)了明顯且較大的透明圈（圖1）。

表1 溶磷菌培養(yǎng)7 d的菌落特征

圖1 菌株6-Y-09在有機(jī)磷培養(yǎng)基上的溶磷圈

2.2 溶磷細(xì)菌的溶磷能力

各菌株在有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，測定其pH和有效磷含量，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，17株溶磷菌溶解有機(jī)磷能力差異顯著，有效磷含量在 34.76-201.38 mg/L之間，與不接菌對照（23.99 mg/L）相比，有效磷增量在 10.77-177.39 mg/L之間，增幅在 44.8%-739.4%之間。其中，菌株6-Y-09的溶磷量為201.38 mg/L，比CK增加了8.39倍，溶磷效果顯著高于其他菌株。

有機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基的溶磷量與pH之間沒有顯著的相關(guān)性，主要原因是有機(jī)磷細(xì)菌主要是通過分泌胞外植酸酶、核酸酶和磷酸酶等非有機(jī)酸類物質(zhì)將有機(jī)酸分解［12］，而這些物質(zhì)對培養(yǎng)液的pH改變不大。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株6-Y-09的形態(tài)特征 菌株6-Y-09在LB培養(yǎng)基上生長較好，速度快，培養(yǎng)48 h后. 菌落為圓形，直徑5 mm，淡黃色，不透明，濕潤，扁平，無色素產(chǎn)生。

2.3.2 菌株6-Y-09的生理生化特征 菌株淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)呈陰性；明膠液化試驗(yàn)、過氧化氯酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)呈陽性；能利用葡萄糖。

2.3.3 16S rDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 將菌株6-Y-09的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到一條1 500 bp左右的條帶，經(jīng)序列測定，其大小為1 333 bp。將其DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的DNA序列進(jìn)行BLAST相似性分析，發(fā)現(xiàn)菌株 6-Y-09與Burkholderia cepacia strain GJ8 同源性最高，相似性達(dá)100%。根據(jù)序列同源性從高到低的原則，挑取9株菌株的16S rDNA序列，運(yùn)用BioEdit、Mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

表2 有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中接種7 d后的溶磷情況

3 討論

本研究采用蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基，對五指山南定和水滿等地區(qū)油茶林地的根際土壤中溶磷菌進(jìn)行分離篩選，利用溶磷圈法，選出溶磷能力較強(qiáng)的菌株17 株，菌株溶解有機(jī)磷D/d值在0.85-4.82之間。進(jìn)一步搖瓶培養(yǎng)對17株菌進(jìn)行復(fù)篩，有效溶磷量在34.76-201.38 mg/L之間。無論是在固體培養(yǎng)條件下的D/d值還是在液體培養(yǎng)條件下的有效溶磷量，菌株6-Y-09均表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶磷能力，因此將其選擇作為進(jìn)一步鑒定的菌株。結(jié)合菌株6-Y-09的菌落形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)，16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株6-Y-09為洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia capacia）。洋蔥伯克霍爾德菌是1950年Burkholder從腐爛洋蔥表皮中分離到的一株植物病原菌［13］，對人本身來說是一種致病性較嚴(yán)重的致病菌，但是在自然界中又是一種重要的生防、環(huán)保菌，減少了對環(huán)境的危害，相關(guān)研究結(jié)果表明洋蔥伯克霍爾德菌能夠產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，包括硝吡咯菌素、吩嗪，Cepabactin，Cepaciamide A等以及其他未被鑒定的物質(zhì)，并具有防治植物病害和促進(jìn)植物生長的雙重功效［14-16］。另外，國外已有利用其開發(fā)出生物農(nóng)藥用于防治小麥紋枯病、小麥全蝕病、番茄南方根結(jié)線蟲病［17，18］、桃褐腐病［19］等，也有其防止植物病害作用機(jī)理的研究報(bào)道［20，21］，洋蔥伯克霍爾德菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)中表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

圖2 菌株6-Y-09的同源性分析

油茶是我國重要的木本油料作物，由于其生長周期長，必須維持土壤肥力才能達(dá)到持續(xù)高產(chǎn)的目的。微生物肥料可以改良土壤理化性質(zhì)，調(diào)節(jié)植物生長，增加作物產(chǎn)量，且對生態(tài)環(huán)境友好，因此推廣和應(yīng)用微生物肥料是推動(dòng)我國油茶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要措施。菌株6-Y-09有望成為溶磷菌劑及復(fù)合菌劑研制的優(yōu)良菌株，本研究為該菌株今后的應(yīng)用、微生物肥料的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。此外，菌株6-Y-09的擴(kuò)繁技術(shù)體系以及該菌株對油茶的長期接種效應(yīng)及其促生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過分離和篩選獲得17 株有溶磷效果的菌株，且菌株6-Y-09表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶磷能力。通過菌落形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)發(fā)育分析等研究，初步鑒定菌株6-Y-09為洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia capacia）。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Isolation，Identification and Phosphate-solubilizing Capacity of Phosphate-solubilizing Bacteria from the Rhizosphere of Camellia

Liu Xiaoyu Fu Dengqiang Chen Liangqiu Yang Weibo Li Dongxia Fu Haiquan
（Coconut Research Institute，Oil Camellia Research Center，CATAS，Wenchang 571339）

Phosphate-solubilizing bacteria were isolated from the rhizosphere of camellia， and 17 strains were screened using traditional method of isolation and culture of microorganisms. By utilizing the method of transparent zone， phosphate-solubilizing bacteria were preliminarily screened from the rhizosphere soil. Subsequently， the bacteria were re-screened by using method of molybdenum-antimony antispectrophotometric to measure content of soluble phosphorus in fermentation liquor， and strain 6-Y-09 with the highest capacity of solubilizing phosphate was gained. According to morphology of the colony， physiological and biochemical properties， 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis， strain 6-Y-09 was identified as Burkholderia capacia. The strain has great potential in further development of microbiological fertilizer because of its stronger phosphate-solubilizing capability， which will provide an outstanding strain resource for improving phosphorus supply of camellia and promoting its growth.

camellia rhizosphere；phosphate-solubilizing bacteria；isolation and identification；Burkholderia capacia

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.025

2014-09-04

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（314147）

劉小玉，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士研究生，研究方向：土壤微生物與油茶豐產(chǎn)栽培技術(shù)；E-mail：liuxiaoyu06120210@163.com