翟頎 黃兵 董輝 趙其平 朱順海 梁思婷 李莎 楊斯涵 韓紅玉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保守蛋白CHP559基因克隆與真核表達(dá)

翟頎 黃兵 董輝 趙其平 朱順海 梁思婷 李莎 楊斯涵 韓紅玉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

為構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保守蛋白EtCHP559基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，并轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。利用5' RACE技術(shù)克隆獲得了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtCHP559基因全長(zhǎng)cDNA序列，該基因全長(zhǎng)為1 746 bp，ORF為104-1 327 bp，編碼407個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量約為46 kD，并利用生物信息學(xué)分析該基因編碼蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等特征，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到含完整開(kāi)放閱讀框的基因片段，并將其與真核表達(dá)載體pcDNA3.1-flag連接，構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，所構(gòu)建的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切鑒定，可見(jiàn)一條大小約為1 224 bp的目的條帶；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，免疫印跡檢測(cè)可見(jiàn)大小約為47 kD的目的蛋白條帶，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示在DF-1細(xì)胞中檢測(cè)到綠色熒光。這些研究結(jié)果表明已成功獲得了EtCHP559的全長(zhǎng)序列，并成功構(gòu)建了EtCHP559的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，在真核細(xì)胞DF-1中獲得表達(dá)，為深入研究EtCHP559的功能奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；CHP559基因；DF-1細(xì)胞；真核表達(dá)

雞球蟲(chóng)病在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)健康發(fā)展，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病主要是由幾種艾美耳球蟲(chóng)寄生于雞腸道引起。而在幾種艾美耳球蟲(chóng)中，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）是分布最廣、致病力最強(qiáng)的球蟲(chóng)之一，常作為研究雞球蟲(chóng)病的一種模式物種［1］。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)寄生在絨毛上皮和盲腸的黏膜下，引起出血性腸炎，可導(dǎo)致雞死亡，尤其對(duì)雛雞危害最大。雞球蟲(chóng)屬于頂復(fù)器門(mén)原蟲(chóng)，頂復(fù)器原蟲(chóng)多數(shù)是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，都需要入侵宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖完成整個(gè)生活史，其共有的特征是具有由幾種專(zhuān)門(mén)分泌蛋白的細(xì)胞器構(gòu)成的頂端復(fù)合體，這些細(xì)胞器包括微線(xiàn)體、棒狀體和致密顆粒，這些特殊細(xì)胞器分泌的蛋白參與了蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞。在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞這一過(guò)程中，蟲(chóng)體黏附宿主細(xì)胞后，在蟲(chóng)體頂端和宿主細(xì)胞膜表面形成一個(gè)緊密的運(yùn)動(dòng)接觸環(huán)（Moving Junction，MJ）［2］。對(duì)弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)等頂復(fù)器門(mén)原蟲(chóng)的研究表明，該結(jié)構(gòu)對(duì)蟲(chóng)體成功入侵宿主細(xì)胞起至關(guān)重要的作用［3］。

研究發(fā)現(xiàn)由微線(xiàn)分泌的頂體膜抗原1（Apical membrance protein-1，AMA1）是組成MJ的關(guān)鍵分子，該分子與棒狀體分泌的蛋白形成的復(fù)合體是MJ的主要成分［4］。由于MJ在頂復(fù)器原蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此與頂膜抗原1相互作用的分子可能參與形成MJ，在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中也是必不可少的。為了弄清楚柔嫩艾美耳球蟲(chóng)AMA1的相互作用分子以及在蟲(chóng)體入侵過(guò)程中發(fā)揮的作用，本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交技術(shù)，以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)頂體膜抗原1（EtAMA1）為誘餌，篩選了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，獲得一些潛在的與EtAMA1相互作用蛋白的ESTs序列［5］。本研究選取其中編號(hào)為559的EST序列，運(yùn)用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得該基因含完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的全長(zhǎng)cDNA序列。Blast分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白是柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的保守蛋白（conserved hypothetical protein），因此將該基因命名為EtCHP559。利用RT-PCR擴(kuò)增其ORF區(qū)，構(gòu)建該基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞雞胚成纖維細(xì)胞DF-1中進(jìn)行表達(dá)，旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)株 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)純種（CAAS211116-11），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物寄生蟲(chóng)病研究室保存提供。

1.1.2 菌種、細(xì)胞和載體 大腸桿菌TOP10購(gòu)自上海天根生物技術(shù)有限公司，真核細(xì)胞DF-1由本所丁鏟老師饋贈(zèng)，pGEM-T-easy vector購(gòu)自美國(guó)Promega公司，真核表達(dá)載體pcDNA3.1-flag，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院崔曉嫻博士饋贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑 DL2000（DNA Maker）、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、2*Taq PCR MasterMix，購(gòu)自上海天根生物技術(shù)有限公司。Trizol、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。T4 DNA連接酶、購(gòu)自美國(guó)Promega公司。GeneRacerTMKit、Lipofectamine 2000，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM、opti-MEM，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。近紅外熒光羊抗兔二抗，購(gòu)自L(fǎng)I-COR公司。RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。綠色熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗，購(gòu)自Jackson Immuno Research公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 以純化的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子為材料按Trizol說(shuō)明書(shū)操作，提取子孢子階段蟲(chóng)體的Total RNA，經(jīng)電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，符合要求后用于RACE模板的制備。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

1.2.2.1 RACE引物 根據(jù)編號(hào)為559的EST序列，該序列含有3'端poly（A）尾，利用Primer Premier 5.00軟件設(shè)計(jì)5'端的引物，RACE引物如下，5' Primer：5'-ACCTTCGACCGCTGCCGCTCGTGTTCCT-3'；5'Nest Primer：5'-CCGCTGCCGCTCGTGTTCCTTTTCCC AT-3'。所有引物均由上海賽百盛生物有限公司合成。

1.2.2.2 全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增的引物 將獲得的5'-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，對(duì)PCR鑒定的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，利用DNAstar軟件查找5'-RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將2段序列拼接為全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)拼接的全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增含完整ORF的cDNA片段，在上下游引物引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，上游引物序列為5'-GGATCCATGCGATCCTCGCAGCGTCGGCGCC-3'，下游引物序列為5'-CTCGAGTCGGCTTCATCTCCCGG CCCTTAC-3'。

1.2.3 EtCHP559基因的克隆與測(cè)序

1.2.3.1 EtCHP559全長(zhǎng)基因5'端的擴(kuò)增與測(cè)序 首先利用GeneRaceTMKit對(duì)提取的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子總RNA依次進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)、去mRNA帽結(jié)構(gòu)、連接RNA Oligo、反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行cDNA的5'端擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系含模板1 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1 μL，總體積為25 μL，反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，72℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若有特異性條帶，則回收；若無(wú)特異性條帶，則繼續(xù)進(jìn)行Nested PCR，反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收特異性條帶與pGEM-T-easy vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑菌落過(guò)夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定。經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽(yáng)性菌落，送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3.2 EtCHP559基因含完整ORF的cDNA克隆及測(cè)序 利用DNAstar軟件查找5' RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將兩段序列拼接為全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接的全長(zhǎng)cDNA序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)兩端引物（引物引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ、XhoⅠ），以mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系含模板2 μL，上下游引物各1 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 45 s，57℃ 45 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥盏奶禺愋訮CR產(chǎn)物同5' RACE產(chǎn)物一樣連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)鑒定正確后測(cè)序。

1.2.4 EtCHP559基因的生物信息學(xué)分析 利用在線(xiàn)軟件ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html）分析獲得的新基因全長(zhǎng)cDNA序列，找出編碼框。利用ProtParam工具（http：//cn.expasy.org/ tools/protparam. html）計(jì)算編碼蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等。利用TMHMM服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析編碼蛋白有無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP3.0在線(xiàn)分析軟件（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析編碼蛋白有無(wú)信號(hào)肽。利用ProtScale分析軟件（www.expasy. org/cgi-bin/protscale.pl）分析編碼蛋白的疏水性。采用 motif_scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_ scan）尋找氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，了解目的蛋白可能的功能。利用北京大學(xué)生物信息中心WebLab中提供的Antigenic程序（http：//weblab.cbi.pku.edu. cn/program.inputForm.do？program=antigenic）分析其抗原為點(diǎn)。采用NCBI服務(wù)器中的CDD（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml）程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行功能保守功能域分析，判斷該蛋白是否具有完整的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5 真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的構(gòu)建 按上海天根生物技術(shù)有限公司提供的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-EtCHP559，并用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)載體pcDNA3.1-flag和重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-EtCHP559分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂板過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單克隆菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行PCR鑒定；對(duì)鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒用BamHⅠ和Xho I限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送至上海桑尼生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 DF-1細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞前的一周復(fù)蘇DF-1細(xì)胞，將細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中融化后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15 mL無(wú)菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液，傳2-3代，至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。轉(zhuǎn)染前，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液37℃消化2 min，收集DF-1細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每孔60萬(wàn)細(xì)胞鋪被六孔板2塊，37℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟分別將空質(zhì)粒pcDNA3.1-flag和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559轉(zhuǎn)染進(jìn)DF-1細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)6 h，更換為含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，收集一塊六孔板的DF-1細(xì)胞，提取蛋白后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，另一塊六孔板的DF-1細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。

1.2.7 間接免疫熒光（IFA）鑒定蛋白在真核細(xì)胞的表達(dá) 為了檢測(cè)真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)情況，取培養(yǎng)48 h的DF-1細(xì)胞，每孔用2%多聚甲醛2 mL固定15 min，PBS洗滌3次，加入1% Triton X-100 2 mL，室溫下固定15 min，PBS洗滌3次，加入2% BSA/PBS 2 mL，4℃封閉過(guò)夜，PBS洗滌3次，加入抗rEtCHP559蛋白兔源血清（1∶100倍稀釋?zhuān)?7℃作用1 h；PBS洗滌3次，加入1∶400稀釋的綠色熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。

1.2.8 Western blot 鑒定真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA-3.1-flag-EtCHP559在DF-1細(xì)胞的表達(dá)情況 收集培養(yǎng)48 h的DF-1細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min離心2 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。全濕法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜；PBST洗滌3次，加入1∶100稀釋的抗rEtCHP559蛋白兔血清，37℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入1∶15 000稀釋的近紅外熒光羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，再經(jīng)PBS洗滌5次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 CHP559基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)Et CHP559基因的EST序列，利用5' RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得了含一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框（ORF：104-1 327 bp）的全長(zhǎng)cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1 746 bp，包括5'端的UTR序列，長(zhǎng)103 bp，含有CAAT 序列，沒(méi)有TATA 序列；3'端UTR序列，長(zhǎng)419 bp，含Ploy（A）尾，沒(méi)有典型的AATAAA序列，ORF長(zhǎng)1 224 bp，編碼407個(gè)氨基酸（圖1）；預(yù)測(cè)分子量為46.04 kD，等電點(diǎn)為9.12，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為40.44，高于域值40，在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定，脂肪族指數(shù)81.45，總平均親水性-0.223；信號(hào)肽、疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)的分析表明，該基因編碼的蛋白有信號(hào)肽，信號(hào)肽的概率為0.998，其斷裂位點(diǎn)位于第25個(gè)aa和第26個(gè)aa之間，該蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)，其中第1-8個(gè)aa為蛋白的胞內(nèi)區(qū)域，第9-31個(gè)aa為該蛋白的跨膜區(qū)域，第32-407個(gè)aa為蛋白的胞外區(qū)域。疏水性分析顯示最大值為2.611，最小值為-3.511。抗原位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能有15個(gè)抗原位點(diǎn)，推測(cè)具有良好的免疫原性。經(jīng)結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)EtCHP559基因編碼的蛋白可能含有2個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，6個(gè)N端酰化位點(diǎn)，5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。利用NCBI的CDD程序?qū)υ摶蚓幋a的氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行搜索，結(jié)果顯示該基因編碼的氨基酸沒(méi)有保守結(jié)構(gòu)域。與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. genedb.org/Homepage/Etenella）比較發(fā)現(xiàn)，該基因的ORF與保守的假象蛋白（hypothetical protein，conserved，ETH_00024035）100%同源，因此將該基因命名為Et CHP559。

2.2 EtCHP559基因的克隆

利用DNAstar軟件查找5' RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與原EST序列的重疊部分，將兩段序列拼接為全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接的全長(zhǎng)cDNA序列，利用合成的引物以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增含ORF的cDNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 224 bp處有特異性的單一條帶，與預(yù)期大小一致（圖2）；其與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10，菌液PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定正確，表明成功擴(kuò)增獲得EtCHP559基因含完整ORF的cDNA片段。

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的構(gòu)建

分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-EtCHP559和空載體pcDNA3.1-flag進(jìn)行雙酶切，純化后進(jìn)行連接，構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559。對(duì)該重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果（圖3）均為陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果顯示該基因正確插入，表明真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559構(gòu)建成功。

圖1 EtCHP559 cDNA的核苷酸序列及其氨基酸序列

圖2 EtCHP559的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559的PCR與雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)pcDNA3.1-flag-EtCHP559在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)情況

利用抗rEtCHP559蛋白兔血清，對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后的DF-1細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞中，綠色熒光通道可以看到特異的綠色熒光；而在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag空載體和正常的DF-1細(xì)胞中，無(wú)任何可見(jiàn)熒光。結(jié)果表明pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質(zhì)粒能在DF-1細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)。

2.5 Western blot分析pcDNA3.1-flag-EtCHP559在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot結(jié) 果（ 圖5） 顯 示， 轉(zhuǎn) 染 了pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞中可檢測(cè)到大小約為47 kD的目的條帶，而轉(zhuǎn)染空載體的DF-1細(xì)胞中卻沒(méi)有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)，表明pcDNA3.1-flag-EtCHP559重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了DF-1細(xì)胞并在DF-1細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光檢測(cè)

圖5 EtCHP559重組蛋白Western blot分析結(jié)果

3 討論

雖然頂復(fù)器門(mén)原蟲(chóng)入侵的宿主細(xì)胞不同，包括紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和消化道細(xì)胞等，但它們都有一個(gè)共同的高度保守的入侵機(jī)制［6］。 在這一過(guò)程中，運(yùn)動(dòng)接觸環(huán)（MJ）的形成至關(guān)重要，此特殊結(jié)構(gòu)作為支架推動(dòng)蟲(chóng)體進(jìn)入帶蟲(chóng)空泡［7，8］，對(duì)頂復(fù)器門(mén)原蟲(chóng)弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)等研究表明，AMA1通過(guò)與棒狀體頸部蛋白（RONs）相互作用形成的復(fù)合體是構(gòu)成MJ結(jié)構(gòu)的主要成分，參與入侵過(guò)程［3，9，10］。但到目前為止，對(duì)雞球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞時(shí)MJ的分子組成研究還未見(jiàn)報(bào)道，只是對(duì)微線(xiàn)分泌的頂膜抗原AMA1進(jìn)行了一些研究。Jiang等［11］首次克隆到了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的AMA1基因全長(zhǎng)，并在體外用多克隆抗體抑制EtAMA1蛋白后觀(guān)察到子孢子細(xì)胞入侵率下降了70%，表明AMA1蛋白參與了子孢子入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程。為了進(jìn)一步研究柔嫩艾美耳球蟲(chóng)AMA1的功能，薛璞［5］利用酵母雙雜交的方法從柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子酵母cDNA文庫(kù)中篩選到了與EtAMA1相互作用的14個(gè)蛋白的ESTs序列。已有研究表明其中2個(gè)ESTs（EtZB1-A08與EtMIC2）參與了球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程，本研究擴(kuò)增獲得的EtCHP559基因，是根據(jù)其中的一個(gè)EST序列利用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得的，因此該蛋白可能與EtAMA1相互作用，參與了子孢子入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程。

pcDNA3.1載體是一種能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或宿主內(nèi)高水平穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)的真核表達(dá)載體，其含有巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子CMV、BGH、polyA加尾信號(hào)和SV40早期啟動(dòng)子，全長(zhǎng)5 400 bp，還帶有Neo抗性基因便于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選，常用來(lái)融合表達(dá)多種外源基因蛋白以及核酸疫苗的研究［12］。本研究選用的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Flag是由pcDNA3.1（+）改造而獲得的，該載體在pcDNA3.1（+）多克隆位點(diǎn)的N端添加了flag標(biāo)簽，并且在標(biāo)簽序列之前插入了kozak序列。研究發(fā)現(xiàn)真核生物蛋白表達(dá)調(diào)控與蛋白起始密碼子AUG周?chē)膲A基種類(lèi)有很大關(guān)系，當(dāng)一個(gè)基因起始密碼子AUG之前的堿基為kozak序列GCCACC時(shí)，該蛋白表達(dá)量會(huì)有相應(yīng)提高［13］。 Flag是序列為DYKDDDDK蛋白標(biāo)簽，由親水性的8個(gè)氨基酸殘基組成，序列簡(jiǎn)短，對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性影響小，容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合N端或C端，可用Anti-flag抗體檢測(cè)［14］。Flag標(biāo)簽還可設(shè)計(jì)用于免疫親和層析，在非變性條件下洗脫flag標(biāo)簽融合蛋白［15］。因此，本研究利用該載體成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，并在真核細(xì)胞DF-1中成功表達(dá)，表達(dá)的蛋白帶有flag標(biāo)簽，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以用來(lái)純化蛋白，也可以通過(guò)免疫沉淀來(lái)研究蛋白質(zhì)之間的互作等。

近年來(lái)，為了對(duì)雞球蟲(chóng)功能基因和核酸疫苗的研究，許多研究者將雞球蟲(chóng)的功能基因連接到真核表達(dá)載體，成功構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒，并在不同的真核表達(dá)細(xì)胞中獲得表達(dá)。如王艷歌等［16］構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶的真核表達(dá)質(zhì)粒，并在293T細(xì)胞中成功表達(dá)，劉穎麗等［17］在Hela細(xì)胞中成功表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋白2（Et-MIC2），杜愛(ài)芳等［18］以減毒沙門(mén)氏菌為載體，在Vero細(xì)胞中表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)微線(xiàn)蛋白4（Et-MIC4）。但這些細(xì)胞均為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，目前還未見(jiàn)利用球蟲(chóng)宿主雞細(xì)胞來(lái)表達(dá)雞球蟲(chóng)蛋白的報(bào)道。本研究嘗試選擇了雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast cell line，DF-1）來(lái)表達(dá)EtCHP559，DF-1細(xì)胞來(lái)源于East Lansing Line（ELL-0），是一種可無(wú)限傳代的細(xì)胞系，目前，在病毒研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如用于病毒疫苗的生產(chǎn)和重組病毒或蛋白的表達(dá)［19］。黃杰等［20］在DF-1細(xì)胞中成功表達(dá)了鴨瘟病毒的UL7蛋白，田志革等［21］將新城疫病毒V基因片段與pcDNA3.1載體連接，并在DF-1細(xì)胞中獲得了表達(dá)。近來(lái)，DF-1細(xì)胞也被用于雞球蟲(chóng)體外培養(yǎng)的研究，姜連連等［22］首次將DF-1細(xì)胞應(yīng)用于雞球蟲(chóng)研究領(lǐng)域，將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子接入DF-1細(xì)胞后，子孢子能成功入侵DF-1細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)育至裂殖子，因此該細(xì)胞可用于雞球蟲(chóng)體外研究。本研究在DF-1細(xì)胞中首次成功表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)CHP559蛋白，由于DF-1細(xì)胞是柔嫩艾美耳球蟲(chóng)天然宿主雞的本體細(xì)胞，因此以其為平臺(tái)更有利于研究球蟲(chóng)基因的功能以及與宿主的相互作用關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究利用RACE技術(shù)成功獲得了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保守蛋白EtCHP559基因，并構(gòu)建了其真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-EtCHP559，成功轉(zhuǎn)染到DF-1細(xì)胞中。通過(guò)間接免疫熒光和免疫印跡的方法證實(shí)該基因在真核細(xì)胞DF-1中成功表達(dá)，這些結(jié)果將為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能和球蟲(chóng)核酸疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Gene Cloning and Eukaryotic Expression of a Conserved Hypothetical Protein Gene CHP559 in Eimeria tenella

Zhai Qi Huang Bing Dong Hui Zhao Qiping Zhu Shunhai Liang Siting Li Sha Yang Sihan Han Hongyu
（Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture，Shanghai Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 200241）

The objective of this study is to construct eukaryotic recombinant expression plasmids of a conserved hypothetical protein gene（EtCHP559）of Eimeria tenella， and study the expression of EtCHP559 gene in transfected DF-1 cells. The full-length cDNA of EtCHP559 was cloned using 5'RACE approaches. Bioinformatics analysis revealed that the gene contained 1 746 bp， of which the ORF was 1 224 bp（position 104 - 1 327 bp）encoding 407 amino acids with molecular weight of 46 kD. The deduced amino acid sequence of the protein had a transmembrane region and signal peptide. The cDNA fragment consisting of complete ORF was amplified by RT-PCR， and ligated to the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1-flag. The recombinant plasmid pcDNA3. 1-flag-EtCHP559 was identified successfully by PCR and restriction enzyme digestion， and the target band of approximate 1 224 bp was observed. Subsequently， the recombinant plasmid was transfected into DF-1 cells， Western blot recognized target protein of around 47 kD， and immunofluorescence also showed that green fluorescence in transfected DF-1 cells was observed. These results indicated that the full-length sequence of EtCHP559 was obtained， and the recombinant plasmid of EtCHP559 was successfully constructed and expressed in eukaryotic cells， which laid a foundation for the future research on functions of EtCHP559.

Eimeria tenella；CHP559 gene；DF-1 cell；eukaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.024

2014-10-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201699），中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（2014JB03）

翟頎，男，碩士研究生，研究方向：寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)；E-mail：zhaixiaoqi@126.com

韓紅玉，女，副研究員，研究方向：寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)；E-mail：hhysh@shvri.ac.cn