馬媛媛 程飛躍 邢萬金

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021）

綿羊精子赤道膜蛋白片段1（SPESP1）的克隆、原核表達(dá)及純化

馬媛媛 程飛躍 邢萬金

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021）

旨在克隆綿羊Spesp1 cDNA并表達(dá)，得到純化的GST-SPESP1融合蛋白。以綿羊睪丸組織總cDNA為模板，根據(jù)GenBank公布的綿羊基因組序列設(shè)計引物，PCR擴增得到Spesp1 cDNA，構(gòu)建原核表達(dá)重組載體pGEX-Spesp1，將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中表達(dá)，并優(yōu)化其表達(dá)條件，利用SDS-PAGE切膠純化法得到純化的融合蛋白，用Western blot鑒定所得融合蛋白。結(jié)果表明，經(jīng)測序，克隆得到的Spesp1 cDNA序列與GenBank中預(yù)測的cDNA序列對比有兩個堿基不同，并造成一個氨基酸的差異。在E.coli BL21中成功表達(dá)重組融合蛋白，其最優(yōu)表達(dá)條件為：37℃、4 h、0.005% IPTG終濃度，SDS-PAGE和Western blotting中，融合蛋白位于約64 kD處并可以被抗GST和抗羊SPESP1的抗體識別，與預(yù)計相符，表明融合蛋白成功表達(dá)。成功純化得到GST-SPESP1融合蛋白，為研究SPESP1在精卵細(xì)胞膜融合中的功能奠定了基礎(chǔ)。

綿羊；SPESP1；cDNA克隆；原核表達(dá)；蛋白純化

哺乳動物生命的延續(xù)，需要生殖受精產(chǎn)生受精卵進(jìn)而發(fā)育成個體，而精卵細(xì)胞的膜融合是細(xì)胞融合的中心環(huán)節(jié)。雖然這是一個十分重要的作用過程，但對于這個融合的分子機制還知之甚少。根據(jù)已有文獻(xiàn)的報道，精卵膜融合所必須的蛋白分子有精子細(xì)胞膜上的IZUMO1［1，2］，卵細(xì)胞膜上的CD9［3-5］以及近期發(fā)現(xiàn)的IZUMO1配體JUNO［6，7］。利用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，精卵細(xì)胞膜融合最先發(fā)生在精子細(xì)胞膜的赤道段［8］。然而，參與精卵細(xì)胞膜融合的重要精子蛋白IZUMO1在精子頂體反應(yīng)前并不存在于其膜表面，而是在頂體反應(yīng)后才位于赤道和后頂體區(qū)域［1，2，9-11］，因此，如果找到一個只存在于精子細(xì)胞膜赤道區(qū)域的蛋白，將能更清楚地研究精子赤道膜部分如何與卵細(xì)胞進(jìn)行識別并引起下一步反應(yīng)的。因此，精子赤道膜蛋白片段1（SPESP1）引起了本實驗室注意，它不僅只位于精子膜赤道處［12］，而且據(jù)報道抗SPESP1抗體可以抑制人類［13］和小鼠［14］的體外受精過程，敲除Spesp1基因的雄鼠生育能力明顯下降。有實驗結(jié)果表明，SPESP1與參與精卵膜融合并與一些精子膜蛋白重新定位有關(guān)，其中包括IZUMO1在頂體反應(yīng)后的重新定位，同時還發(fā)現(xiàn)在精卵融合中與形成完整的精子膜有關(guān)［15］。本實驗準(zhǔn)備克隆綿羊SPESP1蛋白的cDNA，構(gòu)建原核表達(dá)重組載體，并于大腸桿菌BL21中表達(dá)得到GST-SPESP1重組融合蛋白，旨在為之后研究其與IZUMO1等相關(guān)蛋白的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株E.coli DH5α和BL21、質(zhì)粒pGEX-4T-1均為本實驗室保存；綿羊睪丸購自西口子屠宰場；雌性小鼠購自于內(nèi)蒙古大學(xué)動物中心。GST單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小提和瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T載體、RNAiso Reagent（D312）、PrimeScript RT reagent Kit、Premix Taq、T4 DNA Ligase、QuickCut限制酶BamH I、EcoR I與其它常規(guī)生化試劑均購自大連寶生物工程有限公司；華大基因有限公司進(jìn)行DNA測序。小鼠抗羊SPESP1腹水多克隆抗體為本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 綿羊SPESP1 cDNA的克隆及重組表達(dá)載體pGEX-Spesp1的構(gòu)建 切取新鮮屠宰綿羊的睪丸組織50-100 mg，并根據(jù)TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒操作步驟提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備綿羊睪丸組織總cDNA。根據(jù)GenBank中預(yù)測的綿羊Spesp1 cDNA序列（NC_019464.1），在其編碼區(qū)的上下游各選取一段設(shè)計一對特異性引物。上游引物：5'-GACGCATGGCGGAGTGCTGT-3'；下游引物：5'-CTAACATGCTTATTTCTCCC-3'，引物由華大基因有限公司合成。預(yù)期擴增產(chǎn)物長度為1 095 bp。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，用設(shè)計好的特異性引物進(jìn)行PCR擴增，程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共29個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切取1 000-2 000 bp之間的條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒提取純化PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，選取5個陽性菌落進(jìn)行測序。

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計含有BamH I和EcoR I酶切位點的表達(dá)引物，其中上游引物：5'-TCGGGATCCGCGTATCGAAGAGT-3'（下劃線為BamH I酶切位點），下游引物：5'-GGAATTCGCATAGTTAGCTTGAATC-3'（下劃線為EcoR I酶切位點，斜體為終止密碼子），以已構(gòu)建好的pMD19-T-Spesp1重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴增，預(yù)期擴增產(chǎn)物大小為1 054 bp，擴增程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行29個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將純化的PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pGEX-4T-1同時用BamH I和EcoR I分別進(jìn)行雙酶切，回收純化酶切后的產(chǎn)物，并將二者進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α菌種中，選陽性菌落提取質(zhì)粒用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定，之后測序確定片段正確。將構(gòu)建成功的重組pGEX-Spesp1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。

1.2.2 重組融合蛋白表達(dá) 將成功轉(zhuǎn)化的菌株接種于10 mL的LB培養(yǎng)基中（Amp濃度50 μg/mL；葡萄糖濃度0.5%），37℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600=0.4-0.6之間時，加入IPTG（終濃度為0.01%）37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。最后離心收集10 mL的誘導(dǎo)菌液，超聲破碎后，加入含有β巰基乙醇的蛋白Loading Buffer，對其進(jìn)行SDS-PAGE（12%分離膠）電泳鑒定目的蛋白表達(dá)情況。預(yù)期融合蛋白GST-SPESP1大小為64 kD。

1.2.3 最佳誘導(dǎo)溫度 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，當(dāng)OD600=0.4-0.6時，加入終濃度為0.01%的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。再在25℃、28℃、31℃、34℃和37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)4 h后離心收集菌體，超聲破碎，取部分液體離心收集上清，用SDS-PAGE分析目的蛋白的最佳表達(dá)溫度條件。

1.2.4 最佳誘導(dǎo)時間 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，當(dāng)OD600= 0.4-0.6時，加入終濃度為0.01%的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在上一步確定的最佳溫度條件下，分別誘導(dǎo)表達(dá)2 、3 、4 、5 、6 、7 和8 h后，收集菌液超聲破碎，用SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)時間。

1.2.5 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，在已研究確定的誘導(dǎo)時間和溫度條件下，加入終濃度為0.002%、0.005%、0.01%、0.015%、0.025%、0.03%、0.035%和0.04%的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。以SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)量，確定目的蛋白表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.6 GST-SPESP1融合蛋白的Western blotting鑒定 重組融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別用GST單抗和小鼠抗SPESP1腹水多抗作為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP作二抗，進(jìn)行Western blot確認(rèn)GST-SPESP1的正確性，具體操作同本實驗室之前的報道［16］。

1.2.7 GST-SPESP1融合蛋白的純化 在E.coli BL21（DE3）中大量誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白，離心收集菌體，超聲破碎；經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將PAGE膠放于低溫的飽和KCl中浸泡5 min，切取對應(yīng)片段大小位置的白色條帶，并將其切碎；將碎膠末放入已經(jīng)處理過的透析袋（透析袋用1 mmol/L EDTA煮5 min后再用ddH2O煮5 min處理）中，封口后放入水平電泳槽中60 V過夜；清除透析袋中膠塊后，將袋子放在1×PBS中4℃進(jìn)行蛋白復(fù)性12 h，每隔4 h換一次PBS；收集純化后蛋白保存于-80℃?zhèn)溆谩＜兓鞍滓?jīng)過SDS-PAGE以及Western blotting鑒定。

2 結(jié)果

2.1 Spesp1 cDNA克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

以綿羊睪丸cDNA為模板，PCR擴增出大約1 000 bp的目的片段（圖1-A），與pMD19-T連接后，挑取3個陽性菌落雙酶切鑒定后送往測序，結(jié)果顯示，克隆的綿羊Spesp1 cDNA長度1 095 bp，與預(yù)期相同，其中不含信號肽的編碼區(qū)（CDS）長度為1 032 bp，將序列信息與NCBI中預(yù)測的序列對比發(fā)現(xiàn)，有兩個堿基差異，翻譯為氨基酸后對比顯示，除了NCBI預(yù)測的第88位的谷氨酸（Glu）變?yōu)榱颂於彼幔ˋsp），其它完全一致。序列已上傳GenBank，登錄號為KR003078。

以重組pMD19-T-Spesp1為模板，用含有BamH I和EcoR I酶切序列的引物進(jìn)行PCR，得到含有該酶切位點及Spesp1 cDNA序列的PCR產(chǎn)物。將純化的PCR條帶與pGEX-4T-1雙酶切之后連接，轉(zhuǎn)化后挑取3個陽性菌落，BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，在1 000 bp附近出現(xiàn)條帶（圖1-B），測序后對比顯示，所插入片段的序列沒有發(fā)生變異。

圖1 Spesp1 cDNA的PCR結(jié)果（A）及pGEX-Spesp1的BamH I和EcoR I雙酶切鑒定（B）

2.2 綿羊SPESP1重組融合蛋白在E.coli BL21菌株中的表達(dá)以及條件優(yōu)化

2.2.1 重組融合蛋白表達(dá) 根據(jù)氨基酸分子量計算，不含信號肽的綿羊Spesp1蛋白的分子量為38 kD，GST標(biāo)簽是26 kD，即融合蛋白GST-SPESP1的分子量應(yīng)為64 kD，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用12% SDS-PAGE電泳后在66.2 kD與45 kD間出現(xiàn)特異性條帶（圖2），而同樣條件下的大腸桿菌BL21空菌以及含有pGEX-4T-1質(zhì)粒菌體都不出現(xiàn)該條帶。

2.2.2 最佳誘導(dǎo)溫度 在0.01% IPTG誘導(dǎo)4 h后SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，37℃時融合蛋白最多（圖3，泳道5），上清進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖4）后發(fā)現(xiàn)，上清幾乎不含有該融合蛋白，說明該重組蛋白是以包涵體形式存在。

圖2 pGEX-Spesp1重組蛋白的表達(dá)分析

圖3 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖4 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)上清的SDS-PAGE分析

2.2.3 最佳誘導(dǎo)時間 在其他條件一致的情況下經(jīng)不同時間誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)4 h時重組融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最大（圖5），在4-8 h之間表達(dá)量不隨時間延長而增加，故該重組融合蛋白最佳誘導(dǎo)時間為4 h。2.2.4 最佳誘導(dǎo)IPTG濃度 在其他條件一致的情況下，利用不同濃度的IPTG對其進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過SDS-PAGE電泳（圖6）后發(fā)現(xiàn)，由于高濃度IPTG不利于細(xì)菌生長，所以該重組融合蛋白的IPTG最佳的誘導(dǎo)濃度為0.005%。

圖5 不同時間誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖6 不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.3 GST-SPESP1重組融合蛋白的Western blotting鑒定和純化

為了確定所表達(dá)的條帶是帶有GST標(biāo)簽的，用GST單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢驗。用小鼠抗羊SPESP1腹水多克隆抗體作為一抗鑒定表達(dá)蛋白中含有融合蛋白GST-SPESP1蛋白（圖7）。其都在66.2 kD附近出現(xiàn)特異性條帶，說明表達(dá)的特異性重組融合蛋白是帶有GST的GST-SPESP1。

為了鑒定SDS-PAGE膠提取純化的蛋白是所需的GST-SPESP1蛋白，將其進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)其與pGEX-Spesp1轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)后大量表達(dá)的重組蛋白的位置相同，都出現(xiàn)在66.2 kD附近。分別用GST和小鼠抗羊SPESP1腹水多克隆抗體作為一抗進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其都在66.2 kD附近處出現(xiàn)條帶（圖8）。由此證明，所純化的蛋白是GST-SPESP1重組融合性蛋白。

圖7 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白SPESP1-GST的Western blotting檢測

圖8 切膠純化的融合蛋白SPESP1-GST的Western blotting檢測

3 討論

精子赤道膜蛋白片段1（SPESP1）是已知的參與精卵細(xì)胞膜融合過程的一個重要蛋白，而對于綿羊中編碼該蛋白的cDNA序列以及其在綿羊這一大型哺乳動物中發(fā)揮的生物學(xué)功能卻未有報道。本實驗利用RT-PCR得到綿羊睪丸組織總cDNA，之后參考GenBank中預(yù)測的綿羊Spesp1上下游附近非編碼區(qū)序列設(shè)計引物，之后以總cDNA為模板通過PCR擴增得到大量含部分非編區(qū)的Spesp1的DNA片段，將其測序并與GenBank中預(yù)測的序列進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)有兩個堿基的不同，翻譯成氨基酸序列后產(chǎn)生一個氨基酸的不同，其將預(yù)測的第88位谷氨酸（Glu）變異為天冬氨酸（Asp），這兩氨基酸都是帶負(fù)電荷的極性氨基酸，且差異點不位于蛋白預(yù)測的功能域中，猜測產(chǎn)生這種多態(tài)性的可能原因是由于個體差異。

構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-Spesp1，使得所表達(dá)的蛋白帶有GST標(biāo)簽，以便后期對其進(jìn)行檢測與純化。誘導(dǎo)實驗結(jié)果顯示，該蛋白的最佳表達(dá)條件是37℃、誘導(dǎo)4 h、終濃度0.005% IPTG，重組蛋白主要以包涵體形式存在。通過對上清與全液的SDSPAGE電泳圖對比發(fā)現(xiàn)，可溶性重組蛋白量不隨蛋白表達(dá)量增加而增加，說明表達(dá)蛋白的存在形態(tài)與其表達(dá)總量的相關(guān)性較弱。當(dāng)IPTG終濃度大于0.015%時，蛋白表達(dá)量隨著菌體生長受到抑制而開始減少，因此在表達(dá)量相差不大時，應(yīng)該盡量選取濃度較低IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。蛋白表達(dá)量在誘導(dǎo)時間到達(dá)4 h后，并不隨時間增加而有所增長，但菌體培養(yǎng)時間過長會產(chǎn)生大量次級代謝產(chǎn)物影響后期的純化，應(yīng)盡量選取短的誘導(dǎo)時間。在Western blotting檢測中，發(fā)現(xiàn)抗GST抗體與抗SPESP1抗體識別的條帶位于同一水平上，說明誘導(dǎo)得到的表達(dá)蛋白是帶有GST標(biāo)簽的SPESP1重組蛋白，為之后研究SPESP1體外與其他蛋白相互作用提供材料，為進(jìn)一步闡明SPESP1在精卵融合中作用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實驗成功構(gòu)建了pGEX-Spesp1重組載體，并在E.coli BL21成功表達(dá)了GST-SPESP1重組融合蛋白，并得到了最佳表達(dá)條件是37℃、4 h和IPTG終濃度0.005%。通過GST單克隆抗體和小鼠抗羊SPESP1腹水多克隆抗體作為一抗對其進(jìn)行Western blotting檢測，證實該蛋白是GST-SPESP1重組融合蛋白。在此基礎(chǔ)上，本實驗通過切膠純化的方法得到了純化的GST-SPESP1重組蛋白，并進(jìn)一步證明純化得到了目標(biāo)重組蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Molecular Cloning，Prokaryotic Expression and Purification of Sheep Sperm Equatorial Segment Protein 1（SPESP1）

Ma Yuanyuan Cheng Feiyue Xing Wanjin
（School of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）

The purpose of this study is to clone sheep sperm equatorial segment protein 1 cDNA（SPESP1）， express SPESP1 in prokaryotic cells. Firstly， SPESP1 cDNA was amplified with total cDNA of sheep testicular as template and the designed primers according to the sequence of sheep genome in GenBank. Then the amplified SPESP1 cDNA was cloned into the expression vector pGEX-4T1 to construct pGEXSPESP1， which was transferred into Escherichia coli BL21 for expression and the conditions of expression were optimized. The purified fusion protein by SDS-PAGE gel-slicing was identified by Western blotting. By sequence alignment， two base pairs of cDNA sequence were different between the cloned SPESP1 and the predicted one in GenBank， which led to 1 amino acid varied. The expression of the recombinant fusion protein in E. coli BL21 succeeded under the optimal condition of 37℃ and 0.005% of IPTG for 4 h. SDS-PAGE and Western blotting analysis revealed that a protein at band of approximate 64 kD could be recognized by the antibody of anti-GST and anti-sheep-SPESP1， which was in accord with the prediction， and this implied that expression of fusion protein was achieved. In conclusion， successful gain of purified fusion protein GST-SPESP1 lays a foundation for the functional studies of SPESP1 in the membrane fusion of sperm and egg.

sheep；SPESP1；cDNA cloning；prokaryotic expression；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.023

2014-11-05

國家自然科學(xué)基金項目（31460600），內(nèi)蒙古高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（NJZZ14001）

馬媛媛，女，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：myuan62@163.com

邢萬金，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：xwanjin@imu.edu.cn