鞏斌熊燊源李良遠代蓉萬鵬程石國慶

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000）

胚胎附植期GRB7基因在綿羊子宮內(nèi)膜中的mRNA表達

鞏斌1，2熊燊源1，2李良遠1代蓉2萬鵬程2石國慶2

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000）

旨在探討生長因子受體結(jié)合蛋白7（growth factor receptor bound 7，GRB7）在綿羊胚胎附植期子宮內(nèi)膜中mRNA的表達模式。應(yīng)用半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR分別檢測21 d懷孕母羊全身組織和妊娠第9、13、17、21及25天的懷孕與未孕母羊子宮內(nèi)膜組織GRB7基因的表達。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，GRB7基因在心臟、皺胃、大腸、小腸、瘤胃、下丘腦、大腦、小腦等組織均未檢測出表達，在脾臟、垂體、腎臟、輸卵管、卵巢、膀胱及子宮體等組織出現(xiàn)表達，其中在子宮體、輸卵管及腎臟中呈現(xiàn)較高表達；實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，從綿羊妊娠第9-25天階段，GRB7基因在母羊子宮內(nèi)膜組織的表達量呈逐漸上升趨勢，孕羊GRB7的表達量均顯著高于同一時間點同期發(fā)情的未孕母羊。結(jié)果表明GRB7的mRNA表達具有組織特異性，在胚胎附植期綿羊子宮內(nèi)膜中的mRNA表達顯著升高，表明GRB7可能在早期胚胎附植中發(fā)揮一定作用。

GRB7；綿羊；胚胎附植；子宮內(nèi)膜

哺乳動物的胚胎附植是妊娠建立的標(biāo)識，是胚胎與母體復(fù)雜的多基因雙向調(diào)控的結(jié)果。研究表明，生長因子受體結(jié)合蛋白7（Growth factor receptor bound 7，GRB7）對細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用［1］，而早期胚胎附植與腫瘤侵襲過程具有極大的相似性。湯軍等［2］在早孕小鼠的研究表明，經(jīng)熒光定量PCR檢測未妊娠（d0）和妊娠早期（d1-7）小鼠子宮內(nèi)膜組織均有GRB7 mRNA表達，且在孕5 d達到峰值，免疫組化和蛋白印跡顯示GRB7蛋白在子宮內(nèi)膜的表達規(guī)律與熒光定量PCR基本一致，提示它可能與子宮內(nèi)膜細胞分化、蛻膜化和維持妊娠等方面有關(guān)。GRB7蛋白由535個氨基酸殘基構(gòu)成，結(jié)構(gòu)上具有3個保守區(qū)域：氨基端的富含脯氨酸區(qū)、中間的GM區(qū)和羧基端的SH2結(jié)構(gòu)域［3］。酪氨酸激酶信號通路是細胞生長、分裂和運動的調(diào)節(jié)器。作為一種重要的接合蛋白，GRB7通過與不同酪氨酸激酶受體及其他磷酸化的酪氨酸蛋白相互作用［4］，調(diào)控許多細胞的功能。據(jù)報道，GRB7的功能主要依靠羧基端的SH2結(jié)構(gòu)域。通過SH2結(jié)構(gòu)域，GRB7蛋白與許多信號通路相關(guān)聯(lián)，如胰島素［5］、ErbB2、ErbB3和ErbB4［6］、FAK［7］和FGFR［8］。

鑒于GRB7基因在小鼠胚胎著床過程中發(fā)揮的重要調(diào)控作用，而該基因在綿羊胚胎附植期表達調(diào)控模式的研究尚屬空白，本研究選擇其作為綿羊胚胎附植分子調(diào)控的候選基因。期望通過組織表達譜檢測、半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR，探究其在不同組織和不同胚胎附植階段子宮內(nèi)膜的表達變化情況，為初步探討GRB7在綿羊胚胎附植過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物均來自新疆兵團紫泥泉種羊場。試驗?zāi)秆蜻x擇健康、經(jīng)產(chǎn)、體況優(yōu)良且一致的中國美利奴細毛羊，隨機分為A、B、C、D、E 5組（每組8頭）。經(jīng)過同期發(fā)情處理后，每組留下3只母羊不配種做空白對照，其余發(fā)情母羊采用人工授精配種（間隔12 h左右重復(fù)授精2-3次）。母羊處理和配種期間，嚴(yán)格按照羊場常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)進行飼喂和管理，同時在自由采食及飲水條件下，進行疾病的預(yù)防和行為、體況的觀察。分別于人工授精后第9、13、17、21及25天采集妊娠母羊及同期發(fā)情處理后未配種母羊的子宮內(nèi)膜組織，速置于液氮保存?zhèn)溆?。選取妊娠21 d母羊3只屠宰，采集心臟、脾臟、垂體、腎臟、皺胃、大腸、小腸、瘤胃、下丘腦、大腦、小腦、輸卵管、卵巢、膀胱及子宮體等15種組織，速置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成按照Trizol（Invitrogen）試劑說明書分別提取所需組織的總RNA。利用紫外分光光度計測定OD260/OD280值和RNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。所提總RNA OD260/OD280值在1.85-2.0之間，無蛋白及基因組DNA污染，符合試驗要求。cDNA第一鏈合成按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）進行。

1.2.2 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中綿羊GRB7基因mRNA序列（XM_004013378.1），應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物跨內(nèi)含子并處在基因的高保守區(qū)域。引物序列見表1和表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司上海合成部合成。

表1 組織表達譜的引物序列和片段長度

表2 實時熒光定量RT-PCR的引物序列和片段長度

1.2.3 GRB7基因克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，引物GRB7-F2/R2各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA測序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成，所獲序列經(jīng)鑒定正確。

1.2.4 組織表達譜分析 按前述方法分別提取懷孕第21天母羊心臟、脾臟、垂體、腎臟、皺胃、大腸、小腸、瘤胃、下丘腦、大腦、小腦、輸卵管、卵巢、膀胱及子宮體等組織總RNA，并合成cDNA第一鏈。根據(jù)所設(shè)計的引物GRB7-F2/R2進行PCR擴增。以綿羊β-actin基因為內(nèi)參基因，根據(jù)持家基因指數(shù)擴增期PCR產(chǎn)物灰度值調(diào)整各組織初始模板濃度，并與目的基因指數(shù)擴增期PCR產(chǎn)物灰度值進行比較，半定量分析GRB7基因在所選組織中的相對表達水平。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測 將采集到的各期子宮內(nèi)膜組織，分別提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進行實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)所設(shè)計的引物GRB7-F1/R1進行PCR擴增，以綿羊GAPDH基因為內(nèi)參。反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA模板1 μL，LightCycler?480 SYBR Green I Master（Roche）Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，Water，PCR-grade 7 μL。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，61℃復(fù)性10 s，72℃延伸10 s，共45個循環(huán)。擴增完成后，進行熔解曲線的分析，以判斷擴增過程特異性。每個檢測樣品設(shè)置3個重復(fù)，定量分析結(jié)果由LightCyeler480分析軟件自動分析。

1.2.6 統(tǒng)計分析 實時熒光定量PCR獲得目的基因和持家基因的CT值，采用2-△△CT法［8］計算GRB7基因的相對表達量。利用 SPSS（19.0）軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以柱狀圖顯示各時期的表達水平變化。

2 結(jié)果

2.1 綿羊GRB7基因的克隆

利用GenBank中綿羊GRB7基因mRNA序列（XM_004013378.1），以綿羊子宮內(nèi)膜組織cDNA第一鏈為模板，經(jīng)擴增和測序，獲得一條長度為 181 bp的目的片段（圖1）。經(jīng)PCR產(chǎn)物送測序公司測序，是所設(shè)計的目的片段。

圖1 綿羊GRB7基因的PCR擴增電泳圖

2.2 綿羊GRB7基因的組織表達譜分析

以綿羊β-actin為內(nèi)參基因，采用半定量RTPCR方法檢測了GRB7基因在綿羊懷孕第21天不同組織的表達水平情況。結(jié)果（圖2和圖3）表明，GRB7基因在脾臟、垂體、腎臟、輸卵管、卵巢、膀胱及子宮體等組織出現(xiàn)表達，其中在子宮體、輸卵管及腎臟中表達量較高，但在心臟、皺胃、大腸、小腸、瘤胃、下丘腦、大腦、小腦等組織未檢測出。

圖2 GRB7基因在綿羊不同組織的表達檢測

圖3 綿羊GRB7基因在不同組織表達水平的比較

2.3 綿羊GRB7基因在不同附植期懷孕與未孕母羊子宮內(nèi)膜的表達分析

為了研究GRB7基因在胚胎附植期綿羊子宮內(nèi)膜中mRNA表達情況，利用實時定量熒光PCR方法，以GAPDH為持家基因?qū)Σ煌瑫r間點子宮內(nèi)膜GRB7基因的表達水平進行跟蹤檢測。

實時定量熒光PCR檢測（圖4）發(fā)現(xiàn)，GRB7 mRNA在懷孕組和空懷組綿羊子宮內(nèi)膜中均有表達，且組間表達差異極顯著（P＜0.01）。懷孕組中，與d17相比較，d21的mRNA表達水平差異不顯著（P=0.112），d9、d13、d25的mRNA表達水平均顯著高于d17（P＜0.01）?？諔呀M中，與d9相比較，d21的mRNA表達水平差異不顯著（P=0.322），d13、d17、d25的mRNA表達水平均顯著高于d9（P＜0.01）。

圖4 GRB7基因在懷孕組與未孕組母羊子宮內(nèi)膜不同時間點的表達

3 討論

哺乳動物胚胎附植成功的關(guān)鍵是胚胎和子宮內(nèi)膜在時空上相互識別、容受并發(fā)生黏附聯(lián)系的共同結(jié)果，在此過程中涉及相互之間的復(fù)雜分子調(diào)控過程。在胚胎附植期，子宮內(nèi)膜會產(chǎn)生極短的允許胚胎植入的容受時期即著床窗，著床窗的出現(xiàn)是胚胎定位、黏著和附植的必要條件［9］。胚胎附植過程中，滋養(yǎng)層外胚層與子宮內(nèi)膜發(fā)生黏附反應(yīng)，子宮內(nèi)膜腺上皮基質(zhì)細胞增殖分化成蛻膜細胞，從而支持胚胎發(fā)育［2］。GRB7參與許多腫瘤細胞的移行和發(fā)生，經(jīng)免疫組化分析GRB7的過表達與晚期卵巢癌有關(guān)聯(lián)趨勢［10］，GRB7的遷移可以通過RNA干擾機制降低乳腺癌細胞活性實現(xiàn)［11］，胚泡的植入與腫瘤細胞的侵襲、遷移等方面非常相似。

本研究結(jié)果顯示，對第21天懷孕母羊全身組織進行組織表達譜分析，GRB7在脾臟、垂體、腎臟、輸卵管、卵巢、膀胱及子宮體等組織均出現(xiàn)表達，其中在子宮體、輸卵管及腎臟中表達量較高，但在心臟、皺胃、大腸、小腸、瘤胃、下丘腦、大腦、小腦等組織未檢測出，表明GRB7的表達具有一定的組織特異性，這與其在人體內(nèi)的表達情況不同。人體中，GRB7在胰腺中高表達，腎、胎盤、前列腺及小腸的表達適中，結(jié)腸、肝臟、肺及睪丸中表達較低［3］。湯軍等［2］在早孕小鼠的研究表明，經(jīng)熒光定量PCR檢測未妊娠（d0）和妊娠早期（d1-7）小鼠子宮內(nèi)膜組織均有GRB7 mRNA表達。GRB7在子宮體和輸卵管的高表達暗示其可能與胚胎附植位點子宮內(nèi)膜存在某種聯(lián)系。

進一步對早期妊娠不同時間點母羊子宮內(nèi)膜熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，各時間點妊娠母羊子宮內(nèi)膜GRB7的表達量均極顯著高于同期未孕母羊，且從第9天至25天持續(xù)升高，在25 d達到最大檢測值。綿羊胚胎附植過程大體分為4個階段：囊胚孵化、胚胎伸長、附植預(yù)接觸和胚胎定位與黏附［12］。從透明帶孵化出來的囊胚立即與母體子宮產(chǎn)生密切聯(lián)系，在胚胎伸長的過程中滋養(yǎng)層細胞形成指狀突起，綿羊指狀突起形成的時間為妊娠13 d，之后隨胎盤發(fā)育而消失。綿羊妊娠14 d胚胎滋養(yǎng)層絨毛與子宮內(nèi)膜上皮細胞預(yù)接觸，并在16-18 d發(fā)生黏附，絨毛不斷伸長并出現(xiàn)血管，30 d時與子宮阜的組織形成“母包子型”胎盤［13］。有研究表明，GRB7、ERK和FOXM1的異常上調(diào)和激活與人類腫瘤細胞的侵襲有密切聯(lián)系［10］，GRB7上調(diào)還涉及受體酪氨酸激酶信號通路、促進細胞生存和細胞遷移［11］。熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)妊娠母羊子宮內(nèi)膜GRB7的表達量從第9天至25天持續(xù)升高，與GRB7上調(diào)機理表現(xiàn)出一致性，同時與湯軍等［2］在早孕小鼠妊娠早期的研究結(jié)果基本一致。在25 d表達量達到最大檢測值提示GRB7基因可能影響胎盤的發(fā)生。已知HER2信號通路及其下游效應(yīng)器有助于細胞增殖和遷移，有報道說GRB7與HER2協(xié)同作用［14］，GRB7的二聚作用可能是GRB7與RTKs或erbB2結(jié)合過程中的重要調(diào)節(jié)步驟［15］。本研究顯示GRB7在子宮內(nèi)膜規(guī)律性表達可能與胚胎附植相關(guān)，所調(diào)控的細胞生長、增殖和移行，提示GRB7在子宮內(nèi)膜細胞分化、蛻膜化和維持妊娠方面起一定作用。但由于哺乳動物胚胎附植是一個涉及母體與胎兒復(fù)雜的雙向調(diào)控過程，后續(xù)試驗需要進行懷孕25 d之后的子宮內(nèi)膜和孕體方面研究。

4 結(jié)論

GRB7在綿羊脾臟、垂體、腎臟、輸卵管、卵巢、膀胱及子宮體等組織出現(xiàn)表達，其中在子宮體、輸卵管及腎臟中表達量較高，而在胚胎附植期綿羊子宮內(nèi)膜中的mRNA表達呈動態(tài)時空變化，提示GRB7可能在綿羊早期胚胎附植中發(fā)揮著重要的作用。

［1］Pias SC， Peterson TA， Johnson DL， et al. The intertwining of structure and function：proposed helix swapping of the SH2 domain of Grb7， a regulatory protein implicated in cancer progression and inflammation［J］. Crit Rev Immunol， 2010， 30（3）：299-304.

［2］湯軍， 李榮， 耿艷清， 等. GRB7基因在早孕小鼠子宮內(nèi)膜中的表達［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2013， 38（10）：1149-1153.

［3］張丹， 高友鶴. 生長因子受體結(jié)合蛋白7（Grb7）研究進展［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床， 2011， 31（4）：467-470.

［4］García-Palmero I， Villalobo A. Calmodulin regulates the translocation of Grb7 into the nucleus［J］. FEBS Letters， 2012， 586：1533-1539

［5］Kasus-Jacobi A， Bereziat V， Perdereau D， et al. Evidence for an interaction between the insulin receptor and Grb7. A role for two of its binding domains， PIR and SH2［J］. Oncogene， 2000， 19：2052-2059.

［6］Fiddes RJ， Campbell DH， Janes PW， et al. Analysis of Grb7 recruitment by heregulin-activated erbB receptors reveals a novel target selectivity for erbB3［J］. J Biol Chem， 1998， 273：7717-7724.

［7］Han DC， Guan JL. Association of focal adhesion kinase with Grb7 and its role in cell migration［J］. J Biol Chem， 1999， 274：24425-24430.

［8］Cailliau K， Le Marcis V， Bereziat V， et al. Inhibition of FGF receptor signalling in Xenopus oocytes：differential effect of Grb7， Grb10 and Grb14［J］. FEBS Lett， 2003， 548：43-48.

［9］Mohamed OA， Jonnaert M， Labelle-Dumais C， et al. Uterine Wnt/ beta-catenin signaling is required for implantation［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102（24）：8579-8584.

［10］Chan DW， Hui WWY， Cai PCH， et al. Targeting GRB7/ERK/ FOXM1 signaling pathway Impairs aggressiveness of Ovarian cancer cells［J］. PLoS One， 2012， 7（12）：1-10.

［11］Nencioni A， Cea M， Garuti A， et al. Grb7 upregulation is a molecular adaptation to HER2 signaling inhibition due to removal of Akt-mediated gene repression［J］. PLoS One， 2010， 5（2）：1-10.

［12］ Spencer TE， Johnson GA， Fuller W， et al. Implantation mechanisms：insights from the sheep［J］. Reproduction， 2004， 128：657-668.

［13］熊燊源， 萬鵬程， 石文艷， 等. 綿羊胚胎附植分子調(diào)控研究進展［J］. 生命科學(xué)， 2012， 24（10）：1105-1113.

［14］Pradip D， Bouzyk M， Dey N， et al. Dissecting GRB7-mediated signals for proliferation and migration in HER2 over expressing breast tumor cells：GTP-ase rules［J］. Am J Cancer Res， 2013，3（2）：173-195.

［15］Peterson TA， BenallieRL， Bradford AM， et al. Dimerization in the Grb7 Protein［J］. J Mol Recognit， 2012， 25（8）：427-434.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

The mRNA Expression of GRB7 in Ovine’s Endometrium During Embryo Implantation

Gong Bin1，2Xiong Shenyuan1，2Li Liangyuan1Dai Rong2Wan Pengcheng2Shi Guoqing2
（1. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000；2. Animal Husbandry and Veterinary Institute，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi 832000）

The goal of this study is to characterize the mRNA expression patterns of growth factor receptor bound 7（GRB7）gene in ovine’s endometrium. The expression profiling of tissues from whole body of a 21 d pregnant ewe was analyzed by semi-quantitative RT-PCR，and the expressions of endometrium samples from non-pregnant and pregnant ewes of 9， 13， 17， 21 and 25 d respectively were examined by realtime fluorescent quantitative RT-PCR. The results of semi-quantitative RT-PCR showed that no expression of GRB7 was detected in the tissues of heart， abomasums， large intestine， small intestine， rumen， hypothalamus， brain and cerebellum：however， the expression was observed in the tissues of spleen， hypophysis， kidney， oviduct， ovary， bladder and uterine， and the level was higher in uterine， oviduct and kidney. The RT-PCR analysis demonstrated that the mRNA expression level of GRB7 in endometrium of a pregnant ewe was higher than that in the concurrent nonpregnant one， and the tendency of expression was gradually rising with the time during period of 9-25 d pregnancy. In conclusion， GRB7 was expressed tissue-specifically， and the significant expression of GRB7 in endometrium of pregnant ewes implies that GRB7 may play a certain role in the earlier stage of embryo implantation.

GRB7；ovine；implantation；endometrium

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.022

2014-10-15

國家科技支撐計劃（2011BAD28B05-1-1），國家“863”計劃（2011AA100307），國家自然科學(xué)基金項目（31160460），新疆兵團綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室開放課題（2013KLS02）

鞏斌，男，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：1156199957@qq.com

石國慶，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：綿羊繁育與家畜胚胎生物技術(shù)研究；E-mail：nkkxyxms@163.com萬鵬程，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：綿羊繁育與家畜胚胎生物技術(shù)研究；E-mail：pengcheng.wan@gmail.com