龐歡瑛周澤軍張燕飛李靜邱明生丁燏簡紀(jì)常吳灶和

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

溶藻弧菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB的免疫原性與免疫保護(hù)性

龐歡瑛1，2周澤軍1，2張燕飛1，2李靜1，2邱明生1，2丁燏1，2簡紀(jì)常1，2吳灶和2，3

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點實驗室，湛江 524088；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

旨在研究溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB作為疫苗候選抗原的可能性，根據(jù)已發(fā)表的全基因組序列，設(shè)計特異性引物PCR擴(kuò)增tolB的基因全長序列。序列分析顯示，該基因（GenBank登錄號JQ846501）全長1 353 bp，共編碼450個氨基酸殘基。BLAST分析發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌tolB基因與其他已知弧菌的tolB具有較高的同源性，序列保守，可作為共同抗原候選蛋白。用原核表達(dá)的tolB蛋白免疫SPF級小鼠，制備多克隆抗體，ELISA效價達(dá)1∶40 000。免疫印跡表明鼠抗tolB血清能與誘導(dǎo)后的重組蛋白發(fā)生特異反應(yīng)。為進(jìn)一步研究tolB對石斑魚（Epinephelus awoara）的免疫保護(hù)性，用TolB蛋白兩次免疫石斑魚，ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)，免疫石斑魚血清的抗體效價在第4周達(dá)到峰值（1∶2 048）。攻毒實驗結(jié)果表明TolB對石斑魚的免疫保護(hù)率為76%。結(jié)果表明，溶藻弧菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB具有較好的免疫原性和免疫保護(hù)性，可作為弧菌亞單位疫苗的候選抗原。

溶藻弧菌；tolB基因；免疫原性；免疫保護(hù)

溶藻弧菌是一種嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌，廣泛分布于世界各地，是水生動物弧菌病的主要病原菌之一［1-3］。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的持續(xù)惡化，溶藻弧菌病不斷暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。此外，該菌可導(dǎo)致人類的食物中毒等多種疾?。?，5］，嚴(yán)重危害人類健康。

長期以來，針對弧菌病的防治仍然以化學(xué)藥物及抗生素為主，但由此導(dǎo)致的藥物殘留及細(xì)菌耐藥問題也日趨嚴(yán)重，因此尋找免疫原性更強(qiáng)，保護(hù)力更高，毒副作用更低的基因工程亞單位疫苗漸受關(guān)注［6，7］。目前利用疫苗預(yù)防弧菌病的研究已取得進(jìn)展，滅活菌體、脂多糖、鞭毛蛋白等菌體成分被證明具有良好的免疫原性［8-10］，一些亞單位疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗也顯示了良好的免疫保護(hù)［7，8，11］。但在實際生產(chǎn)應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，一種疫苗難以防治溶藻弧菌種內(nèi)眾多血清型的感染，更不用說防治其他弧菌的感染，因此只有制備跨科屬種而不僅僅是種內(nèi)保護(hù)作用的疫苗才能滿足海水養(yǎng)殖弧菌病防制治的需要。

Tol-Pal（Translocation-Peptidoglycan associated lipoprotein）系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌高度保守的膜蛋白系統(tǒng)之一，主要由5個相互接觸的蛋白組成，分別是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB蛋白（Translocation protein B）、Pal蛋白、TolA蛋白、TolR蛋白和TolQ蛋白，其中TolA 蛋白、TolQ 蛋白和 TolR 蛋白組成了細(xì)菌的內(nèi)膜蛋白復(fù)合體，而 TolB 蛋白和 Pal 蛋白則組成了細(xì)菌外膜復(fù)合體［12］。Tol-Pal系統(tǒng)確切功能目前尚不十分清楚，一般認(rèn)為該系統(tǒng)對于維持革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性非常重要［13］，此外，一些研究認(rèn)為該系統(tǒng)其也參與細(xì)菌的致病過程。在大腸桿菌內(nèi)，Tol-Pal系統(tǒng)的主要功能是將A 類大腸桿菌毒素輸送至胞外并轉(zhuǎn)運(yùn)至敏感的宿主靶細(xì)胞內(nèi)，最后導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［14］。在霍亂弧菌（Vibrio cholera）中，Tol-Pal系統(tǒng)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)霍亂毒素進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而發(fā)揮其毒力［15］。在鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）中，Tol-Pal系統(tǒng)提高其耐受膽鹽的能力，保證其順利地侵染宿主［16］。Tol-Pal系統(tǒng)中的TolB位于細(xì)胞膜表面，廣泛與外界接觸，而且又是病原菌轉(zhuǎn)運(yùn)毒素的必要裝置，推測其極可能是一種共同抗原。但縱觀國內(nèi)外，目前鮮見關(guān)于溶藻弧菌Tol-Pal系統(tǒng)的免疫原性和免疫保護(hù)性的相關(guān)研究報道。本試驗在項目組已完成TolB體外異源表達(dá)［17］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究TolB蛋白的免疫原性和對石斑魚的免疫保護(hù)性，以期為高效亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 溶藻弧菌強(qiáng)毒株HY9901，由本實驗室自廣東湛江海域患病紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）魚體中分離并保存［18］；大腸桿菌BL21（DE3）和表達(dá)載體pET-28a（+）由本實驗室保存；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.1.2 實驗動物 SPF級8周昆明小鼠（22.5±2.5）g購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，在溫度18-22℃，相對濕度50%-60%條件下，飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗。健康石斑魚（Epinephelus awoara）體重（15±2）g購自湛江某魚場，在水溫20℃下，每日投喂小雜魚，室內(nèi)暫養(yǎng)一周后用于實驗。

1.1.3 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；BamH I和Sal I等限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自NEB公司；預(yù)染蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購自天根公司；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純；PCR引物合成和序列測定均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成；抗生素使用濃度為：氨芐西林（Amp）100 μg/mL、卡那霉素（Kan）50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌HY9901總DNA的提取和tolB基因的擴(kuò)增 將溶藻弧菌HY9901菌株涂布于大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上，挑選單菌落接種于TSB（5% NaCl）培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)12 h以上。取適量菌液于Ependoff離心管中，10 000 r/min離心1 min收集菌體，參照試劑盒說明書提取基因組DNA。根據(jù)GenBank上登錄的溶藻弧菌全基因序列（ACCESSION：NZ_AAPS00000000）設(shè)計一對引物，上游引物P1為：5'-ATGATTAGACGCCTTTTACTA-3'，下游引物P2為：5'-CTACAAAAACGGTGACCA-3'。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后切膠回收，然后克隆至pMD18-T載體，菌落PCR鑒定后將陽性克隆送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)純化 按照文獻(xiàn)［17］進(jìn)行。將tolB基因與原核表達(dá)載體pET-28a連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后使用HisTrap HP親和柱純化目的蛋白，-20℃保存。

1.2.3 TolB蛋白免疫小鼠 將純化的融合蛋白皮下多點注射免疫SPF級昆明小鼠。每只小鼠免疫200 μg融合蛋白，以注射PBS為對照。每隔7 d加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次。首次注射的抗原為蛋白或PBS與完全佐劑混勻制備，后3次注射的抗原均采用蛋白或PBS與不完全佐劑混勻制備。末次加強(qiáng)免疫后1周眼球取血，離心分離血清，測定效價后冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 石斑魚的免疫和攻毒 石斑魚100尾隨機(jī)分成對照組和注射組，每組50尾。對照組分別注射100 μL PBS，免疫組注射100 μL TolB蛋白（1 000 μg/mL）。在首次免疫后第3周，對免疫組石斑魚進(jìn)行第2次免疫，方法同第1次。首次免疫后，每周取樣一次，每組取3尾魚，尾靜脈采血0.5 mL，室溫下靜置2 h后4℃過夜，12 000 r/min離心10 min，分離血清，-80℃保存，ELISA測定抗體效價。免疫后第4周，進(jìn)行攻毒試驗，每尾魚肌肉注射0.2 mL溶藻弧菌HY9901（6.0×108cfu/mL），每天觀察魚的動態(tài)，記錄死亡情況，對部分發(fā)病及死亡魚進(jìn)行病理檢查和病原菌分離，并計算其相對免疫保護(hù)力（RPS）：

1.2.5 特異性檢測和抗血清效價測定 將誘導(dǎo)表達(dá)后的融合蛋白和溶藻弧菌HY9901的全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)印，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜。用鼠抗血清與之反應(yīng)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG。各步驟之間用含體積分?jǐn)?shù)0.1%的Tween 20的磷酸緩沖液（TTBS）洗膜4次，每次10 min。最后用DAB顯色液顯色至有清晰的目的條帶出現(xiàn)，用無菌水終止反應(yīng)，將膜置于濾紙上自然干燥。

利用純化的融合蛋白為抗原包被96孔板，根據(jù)預(yù)實驗確定最適抗原濃度為每孔10 μg /100 μL。待測鼠抗血清或石斑魚抗血清為一抗，第1孔稀釋100倍或64倍，以后倍比稀釋。注射PBS后的血清作陰性對照，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或者兔抗石斑魚IgM為二抗，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液顯色后酶標(biāo)儀測定抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 tolB基因的克隆和序列分析

PCR擴(kuò)增得到一條約1.3 kb的特異條帶（圖1-A），克隆至pMD18-T載體，菌落PCR也擴(kuò)增出1.3 kp的條帶（圖1-B）。測序表明，tolB基因含有一個1 353 bp的開放讀碼框（ORF），編碼450個氨基酸（圖2），預(yù)測分子量約為49.7 kD，等電點為9.49。將該基因提交至GenBank，其登錄號為JQ846501。

圖1 tolB基因的克?。ˋ）和菌落PCR（B）

對tolB基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行N端信號肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在第22-23位氨基酸為信號肽；并發(fā)現(xiàn)該蛋白第24-43位氨基酸為跨膜區(qū)（圖2）。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，TolB位于胞外基質(zhì)中可能性最大，為66.7%，其次為細(xì)胞質(zhì)和囊泡，可能性均為11.1%。InterProScan Sequence Search程序預(yù)測結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)該蛋白含有1個N-terminal結(jié)構(gòu)域（24-122 aa），3個PD40-like β-螺旋結(jié)構(gòu)域（223-248、256-292和300-336 aa）。

圖2 溶藻弧菌HY9901 tolB基因核苷酸及其編碼的氨基酸序列

BLAST分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌TolB基因與其他已知物種的TolB具有較高的同源性，其中TolB氨基酸序列與副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的TolB氨基酸序列的同源性最高達(dá)94%，多序列相似性比較表明TolB是高度保守的（表1）。

表1 溶藻弧菌HY9901 tolB基因推導(dǎo)氨基酸序列與其他弧菌相應(yīng)序列同源性比較

2.2 TolB蛋白的免疫原性分析

TolB免疫小鼠后，ELISA檢測鼠抗血清效價在1∶40 000以上。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，TolB抗血清不僅能與融合蛋白發(fā)生反應(yīng)（圖3 第2泳道），而且能與天然的溶藻弧菌全菌蛋白發(fā)生反應(yīng)（圖3 第3泳道），在53 kD處有印跡帶，注射PBS后的血清不能與53 kD帶發(fā)生反應(yīng)（圖3 第1泳道）。

圖3 TolB的免疫印跡

圖4 間接ELISA法測定的免疫魚抗體效價

2.3 血清抗體效價變化

TolB免疫后的石斑魚，分別在第2、3、4、5、6和7周采血和收集血清，用間接ELISA法測定抗體效價。結(jié)果（圖4）表明，石斑魚在免疫后都發(fā)生特異免疫反應(yīng)，所有免疫組與非免疫對照組間都存在顯著差異（P＜0.05），在第2周即可檢測到抗體的產(chǎn)生，在第4周抗體水平達(dá)到峰值（1∶2 048），在第7周實驗結(jié)束時，所有免疫組的抗體效價均維持在1∶64以上。

2.4 石斑魚的免疫保護(hù)分析

TolB蛋白免疫石斑魚后第4周，進(jìn)行攻毒實驗。結(jié)果（圖5）表明，對照組魚在感染第3天開始死亡，并且出現(xiàn)了明顯癥狀，如運(yùn)動和攝食能力下降，出現(xiàn)腹水和體表潰瘍等，從肝、腎中重新分離到了溶藻弧菌，確認(rèn)死于攻擊引起的感染。在感染后2周內(nèi)，對照組的石斑魚全部死亡；免疫組的死亡率為24%，相對免疫保護(hù)力為76%。

圖5 免疫后用溶藻弧菌HY9901攻毒的存活率

3 討論

對Tol-Pal系統(tǒng)的報道最早始于其對A類大腸桿菌毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)作用［13］，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其功能涉及維持革蘭氏陰性菌的外膜完整性和穩(wěn)定性、發(fā)揮毒力、細(xì)胞分裂、細(xì)菌耐藥性等方面［19］。對鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）Tol-Pal系統(tǒng)的研究表明，tolA基因的缺失可導(dǎo)致其毒力下降［20］，對大腸桿菌（Escherichia coli）細(xì)胞分裂的研究發(fā)現(xiàn)，分裂末期中隔附近聚集了大量 Tol蛋白系統(tǒng)［21］，對福氏志賀菌（Shigella flexneri）耐藥性研究發(fā)現(xiàn)Pal-Tol膜蛋白系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物TolA蛋白，TolQ蛋白和TolB蛋白可能與其多藥耐藥性存在一定的關(guān)系［22］。但是有關(guān)Tol-Pal系統(tǒng)相關(guān)蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)性功能尚未知曉。本研究通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列中存在3個PD40-likeβ-螺旋結(jié)構(gòu)域。相關(guān)研究表明，該結(jié)構(gòu)域通過識別轉(zhuǎn)運(yùn)大腸桿菌素等致病性蛋白質(zhì)毒素［14］，參與細(xì)菌的致病過程，因此溶藻弧菌TolB在致病過程中可能參與毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)。但是TolB蛋白能否引起宿主良好的免疫反應(yīng)，從而作為疫苗的有效成分，尚不得而知。為解決以上問題，筆者將用純化的融合蛋白免疫SPF級小鼠，獲得了高效價的抗血清，ELISA檢測效價達(dá)1∶40 000，表明在弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑的協(xié)助下，融合蛋白在小鼠中能夠引發(fā)很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。更重要的是，鼠抗TolB的血清不僅與融合蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，而且也能與天然溶藻弧菌的全菌蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，提示溶藻弧菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TolB是它的主要抗原之一，具備了成為疫苗候選成分的基本條件。

很多研究表明，外膜蛋白具有良好的免疫原性［23-25］，而且有些外膜蛋白還是很好的共同抗原，是研制基因工程疫苗的良好材料。如Li等［26］發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OmpK廣泛存在于弧菌中，對溶藻弧菌、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌均具有高免疫保護(hù)率。在本研究中，通過基因序列的比對發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌Tol-Pal系統(tǒng)中的TolB基因與其他已知物種的TolB具有較高的同源性，其中與副溶血弧菌的TolB氨基酸序列的同源性最高達(dá)94%，多序列相似性比較表明TolB是高度保守的，可能是弧菌的交叉保護(hù)抗原。為驗證TolB的保護(hù)性，筆者將在大腸桿菌中表達(dá)并純化的TolB蛋白免疫石斑魚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫石斑魚血清中也產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體，進(jìn)一步驗證了TolB強(qiáng)的免疫原性；對溶藻弧菌強(qiáng)毒株攻毒感染的免疫保護(hù)率為76%，表明TolB可以作為一個有效候選亞單位疫苗成分，達(dá)到免疫防治的目的。但是，從免疫魚中獲得的血清抗體效價（1∶1 024）低于免疫小鼠獲得的血清抗體效價（1∶40 000）。這種血清抗體效價的差異在其他一些魚類中也存在［27，28］。出現(xiàn)這種差異的原因可能是因為魚類與小鼠相比，免疫系統(tǒng)相對不完善，免疫應(yīng)答能力比小鼠弱。另外，免疫劑量、免疫佐劑以及免疫途徑等，都可能導(dǎo)致免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)效果的不同。今后在TolB免疫劑量、免疫佐劑的選擇、免疫途徑以及采用不同弧菌進(jìn)行攻毒等方面需更進(jìn)一步地開展研究，以期提高該蛋白的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力，為進(jìn)一步制備高效亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)，為海水魚類弧菌病的防治提供有效的途徑。

4 結(jié)論

本研究從溶藻弧菌HY9901成功克隆得到TolB的基因全長序列。該基因（GenBank登錄號JQ84-6501）全長1 353 bp，共編碼450個氨基酸殘基。BLAST比對發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌TolB基因與其他已知弧菌的TolB具有較高的同源性。用原核表達(dá)的TolB蛋白免疫SPF級小鼠，制備多克隆抗體，ELISA效價達(dá)1∶40 000。免疫印跡表明鼠抗TolB血清能與誘導(dǎo)后的重組蛋白發(fā)生特異反應(yīng)。用TolB蛋白兩次免疫石斑魚，ELISA 檢測表明抗體效價在第4周達(dá)到峰值（1∶2 048）。攻毒實驗結(jié)果表明TolB對石斑魚的免疫保護(hù)率為76%。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Immunogenicity and Immunoprotection of Translocation Protein B（TolB）in Vibrio alginolyticus

Pang Huanying1，2Zhou Zejun1，2Zhang Yanfei1，2Li Jing1，2Qiu Mingsheng1，2Ding Yu1，2Jian Jichang1，2Wu Zaohe2，3
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088；3. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

To investigate the possibility of translocation protein B（TolB）from Vibrio alginolyticus HY9901 as a candidate antigen for vaccine production， the full length tolB gene was amplified by PCR and designed specific primers according to the whole genome sequence of V. alginolyticus published in GenBank. Sequence analysis revealed that tolB gene was 1 353 bp and encoded a putative protein of 450 amino acids（GenBank accession number：JQ846501）. BLAST analysis showed that the tolB of V. alginolyticus had high genetic relationship with other known Vibrio， its sequence was conservative， and might be a common antigen candidate protein. The TolB protein of prokaryotic expression was injected into SPF mice to prepare polyclonal antibody， and its titer of ELISA reached 1∶40 000. Western blot indicated that TolB serum reacted specifically with the induced recombinant protein. Further the TolB protein was used as an antigen to immunize grouper（Epinephelus awoara）twice， and ELISA detection found that the antibody titer of the immunized grouper increased to the highest（up to 1∶2 048）in the fourth week. Challenge assay test showed that the immunoprotection rate of TolB to E. awoara was 76%. Therefore the TolB of V. alginolyticus has solid immunogenicity and immunoprotection， and it can be used as a candidate antigen for vaccine of Vibrio subunits.

Vibrio alginolyticus；tolB gene；immunogenicity；immunoprotection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.021

2015-01-09

國家自然科學(xué)基金項目（31402344），廣東省自然科學(xué)基金項目（S2013040014562）

龐歡瑛，女，博士，講師，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制；E-mail：phying1218 @163.com

丁燏，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制；E-mail：dingy @gdou.edu.cn簡紀(jì)常，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制；E-mail：jianjc @gmail.com