張東玲喻達(dá)輝

（1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，廈門 361021；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 510300）

日本鰻鱺I型Cathelicidin基因的克隆與原核表達(dá)

張東玲1喻達(dá)輝2

（1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，廈門 361021；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 510300）

Cathelicidin是目前發(fā)現(xiàn)的一個最大抗菌肽家族，具有多重生物學(xué)功能。旨在探索和利用魚類Cathelicidin抗菌機(jī)制和潛在的生物學(xué)功能。應(yīng)用RACE-PCR技術(shù)獲得日本鰻鱺I型Cathelicidin（AjCathI）基因的cDNA全長序列。AjCathI的cDNA全長為842 bp，開放閱讀框為570 bp，編碼189個氨基酸。氨基酸序列分析表明，AjCathI靠近C端有4個保守的半胱氨酸序列，抗菌成熟肽與香魚（Plecoglossus altivelis）抗菌成熟肽相似性最高，同源性為65.57%。進(jìn)化分析表明，AjCathI與其它魚類親緣關(guān)系較近，處于同一個分支上。將AjCathI基因克隆至pET-28a載體，轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，AjCathI以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化、Western blot驗證和透析復(fù)性，獲得高純度的重組蛋白。

日本鰻鱺；Cathelicidin；抗菌肽；RACE-PCR

抗菌肽又稱宿主防御肽，作為生物體非特異性免疫的一個重要組成部分，是宿主防御細(xì)菌、病毒等病原生物體入侵的重要分子屏障，廣泛分布于動植物、昆蟲和細(xì)菌等多種生物體內(nèi)。Cathelicidin是目前發(fā)現(xiàn)的一個最大抗菌肽家族，不同的Cathelicidin前體肽結(jié)構(gòu)相似，包括pro、pre和C端成熟肽3個區(qū)域。Pro區(qū)又稱信號肽區(qū)，引導(dǎo)小肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；Pre區(qū)為結(jié)構(gòu)域，包含一個高度保守的cathelin區(qū)，4個半胱氨酸靠近C端形成兩個分子內(nèi)二硫鍵，直接影響到整個分子的結(jié)構(gòu)；C端成熟肽是一個高度變異的抗菌區(qū)域。Cathelicidin在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，然后切除pro區(qū)域，剩下C端成熟肽發(fā)揮抗菌功能。迄今，已陸續(xù)在盲鰻（Myxin eglutinosa）［1］、大西洋鮭（Salmo salar）［2］、大西洋鱘（Gadus morhua）［3，4］、茴魚（Thymallus thymallus）［5］、香魚（Plecoglossus altivelis）［6］等多種魚類確認(rèn)了Cathelicidin類抗菌肽的存在。但在鰻鱺還未見該抗菌肽的報道，因次，有必要深入研究該抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能。

我國是世界上主要鰻鱺生產(chǎn)國之一，在多年的養(yǎng)殖過程中，病害發(fā)生較為頻繁，病原復(fù)雜，其中以細(xì)菌性和寄生蟲疾病最為嚴(yán)重［7，8］。鰻鱺人工養(yǎng)殖過程中多采用化學(xué)類藥物，如抗生素等，導(dǎo)致細(xì)菌和寄生蟲耐藥性增強(qiáng)、水產(chǎn)品藥殘超標(biāo)及對水環(huán)境污染，這些均嚴(yán)重制約著我國鰻業(yè)的健康發(fā)展［9］?？咕牡闹苽渲饕刑烊徊牧咸崛?、化學(xué)合成和基因工程表達(dá)3種方法，但抗菌肽天然提取原料有限，產(chǎn)量低，提取過程又非常復(fù)雜?；瘜W(xué)合成成本高，價格昂貴，不利于投入實際應(yīng)用。因此，借助成熟的基因工程技術(shù)獲得抗菌肽，開發(fā)藥用價值，是比較切實可行的方法。Cathelicidin抗菌肽具有高效廣譜的抗菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，可在魚病防治中起重要作用，因此倍受關(guān)注。本研究克隆和原核表達(dá)純化日本鰻鱺Cathelicidin，以期為有效控制鰻鱺細(xì)菌性疾病提供新途徑，同時也為魚類抗菌肽的研究提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 pMD18-T 載體購自TaKaRa公司；pET-28a載 體、 大腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）均由本實驗保存。

1.1.2 主要試劑 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 購自Clontech公司；PVDF膜為Roche公司產(chǎn) 品；TRIZOL?Reagent Total RNA Isolation Reagent購自Invitrogen 公司；DAB染色試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺為BBI 公司產(chǎn)品；二硫蘇糖（DDT）、過硫酸銨、TEMED為Amresco公司產(chǎn)品；SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker、預(yù)染Marker購自Fermentas公司；咪唑為Sigma公司產(chǎn)品；Western blot 一抗（His·Tag單抗）為Roche公司產(chǎn)品；二抗（山羊抗鼠IgGAP）購自上海捷瑞生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈣、氯化鈉、無水乙醇、Trisbase、尿素、磷酸氫二鈉等其它常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實驗動物 日本鰻鱺：購自集美大學(xué)海水養(yǎng)殖試驗場，體重約300 g，外觀無明顯病變和損傷。

1.2 方法

1.2.1 日本鰻鱺AjCathI基因cDNA的克隆與序列分析 采用Trizol試劑盒并按照說明提取日本鰻鱺肝臟總RNA，提取的總RNA用1%瓊脂糖電泳檢測完整性。

以RNA為模板，SMARTer IIA oligo和5'- RACE CDS Primer A為反轉(zhuǎn)錄引物（表1），采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit反轉(zhuǎn)錄cDNA。根據(jù)日本鰻鱺的AjCathI EST（GenBank：HS106475，ttp：//www.ncbi.- nlm.nih.gov/）， 設(shè) 計 引 物 擴(kuò) 增AjCathI基因5'端。以cDNA為模板，5CR1和UPM為引物第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共25個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。隨后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，5CR2和Nest為引物第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，70℃退火2 min，5 個循環(huán)；94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸2 min，25 個循環(huán)；72℃延伸5 min。

用DNA膠回收試劑盒回收AjCathI基因的PCR產(chǎn)物，連接于克隆載體pMD18-T，構(gòu)建pMD-AjCathI質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR陽性克隆鑒定后送Invitrogen公司測序。

1.2.2 日本鰻鱺AjCathI原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已獲得的日本鰻鱺AjCathI cDNA序列及pET-28a（+）多克隆位點，設(shè)計引物CF和CR（表1），引物分別加入Nco I和Xho I酶切位點。以日本鰻鱺AjCathI（cDNA）重組pMD18-T陽性質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，以CF、CR為上下游引物，用pfu高保真Taq酶擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物電泳回收純化后，經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切后，克隆于表達(dá)載體pET-28a（+），轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并利用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，經(jīng)PCR陽性克隆鑒定后送Invitrogen公司測序。

1.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化與表達(dá)形式的鑒定 經(jīng)測序準(zhǔn)確后，將攜帶目的基因的pET-28a/ AjCathI的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)受體菌BL21（DE3）。挑取單克隆，接種于LB/KMN培養(yǎng)基，37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，次日按1∶100的比例加入到新鮮的LB/KMN培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min劇烈震蕩培養(yǎng)。分別進(jìn)行誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)菌起始生長量對重組蛋白表達(dá)量的影響。收集菌液，SDS-PAGE蛋白電泳檢測。同時設(shè)空載體，未加IPTG的重組質(zhì)粒作對照。

收集表達(dá)的菌體，超聲波破碎，于4℃，4 000×g離心20 min，分別收集上清和沉淀，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，鑒定重組蛋白表達(dá)的形式。

1.2.4 重組表達(dá)蛋白的純化與Western blot鑒定 大量表達(dá)重組蛋白AjCathI 2-3 L，離心收集菌體。用預(yù)冷的裂解緩沖液懸浮菌體，加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿㏄MSF。冰浴下超聲破碎菌體至菌液較清無黏性（功率400-480 W，破碎5 s間隔10 s，25 min）。4 000×g離心20 min，收集沉淀，再用10 mL 0.5 mol/L尿素，PBS洗滌液各清洗一次，4 000×g離心20 min取沉淀。沉淀用結(jié)合緩沖液充分溶解后，10 000×g離心10 min，取上清用0.45 μm濾膜過濾，濾液經(jīng)AKTA-purifier 100純化系統(tǒng)，金屬鎳螯合層析柱純化。用25 mL洗脫緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，流速1 mL/min，檢測波長A280。收集洗脫峰蛋白，取少量SDS-PAGE電泳。

表1 AjCathI克隆和原核表達(dá)的引物

取純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，100 mA，轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白印跡至PVDF膜上。1%牛血清白蛋白/TBST封閉液1∶6 000稀釋一抗（His·Tag單抗），4℃孵育過夜。1∶10 000稀釋二抗（山羊抗鼠IgG-AP），室溫孵育1 h。DAB顯色，清水洗凈，觀察結(jié)果。

1.2.5 重組表達(dá)蛋白的復(fù)性 采用透析法，將洗脫緩沖液中的8 mol/L尿素逐步降低至6、4、2和1 mol/L透析重組表達(dá)蛋白，最后用PBS溶液透析1次，將目的蛋白溶液中的尿素完全去除。由于蛋白在變性狀態(tài)時疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多會形成可見的沉淀析出。復(fù)性后的蛋白溶解度增加，但仍然會有一些沒有復(fù)性成功的蛋白沉淀，10 000×g離心10 min，收集上清。同時取少量SDS-PAGE電泳檢測復(fù)性后的重組蛋白是否發(fā)生斷裂。

2 結(jié)果

2.1 日本鰻鱺AjCathI基因cDNA的獲得

應(yīng)用特異性引物5CR1、5CR2和SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 提供的通用引物，從日本鰻鱺肝組織擴(kuò)增出一條約300 bp大小的片段，經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和陽性克隆鑒定，得到陽性重組子并測序。結(jié)果得到一條包含5' UTR和一部分編碼在內(nèi)的349 bp的片段，與日本鰻鱺AjCathI 3' Race產(chǎn)物比對，兩者有一個223 bp的重疊區(qū)，經(jīng)過序列拼接和堿基校對最終得到842 bp全長的AjCathI cDNA。AjCathI cDNA序列由69 bp 5' UTR、570 bp ORF和203 bp 3' UTR 三部分組成，編碼189個氨基酸（圖1）。經(jīng)提交GenBank檢索表明，從日本鰻鱺肝臟分離得到的AjCathI基因?qū)儆谛碌腃athelicidin家族基因，GenBank登錄號為AFP72291。

2.2 日本鰻鱺AjCathI基因與其他動物Cathelicidin基因編碼的氨基酸同源性比對與序列分析

日本鰻鱺AjCathI cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與部分已分離到的或由核苷酸推導(dǎo)出的Cathelicidin序列比對，顯示4個半胱氨酸保守位點高度一致，并且同一屬的魚類，Cathelicidin在信號肽氨基酸的組成上基本一致。AjCathI并不含有Cathelin保守區(qū)，與其他動物Cathelicidin氨基酸同源性較低，為25%-53%。參考已報道源于嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶作用的位點，推測AjCathI成熟肽為50個氨基酸（圖1）。AjCathI抗菌成熟肽與香魚抗菌成熟肽相似性最高，同源性為65.57%。系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2）表明，AjCathI與魚類親緣關(guān)系較近，與大西洋鱘Cathelicidin同源性最高，處在同一個分支上。

2.3 日本鰻鱺AjCathI的原核表達(dá)

取單克隆陽性鑒定，測序，結(jié)果證明連接正確，核苷酸的開放閱讀框（ORF）編碼連續(xù)，并連有6個His標(biāo)簽，最終獲得正確構(gòu)建的pET-28a /AjCathI表達(dá)載體。將pET-28a /AjCathI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15% SDSPAGE，對凝膠染色、脫色后，重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒相比，具有明顯的表達(dá)蛋白帶，重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白分子量在19.0 kD左右，與計算的理論分子量19.575 kD相似（圖3）。

2.4 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定

取表達(dá)菌體超聲波破碎并離心后的上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖4）顯示，可見表達(dá)產(chǎn)物絕大部分以包涵體形式存在于菌體沉淀中，菌體上清中幾乎沒有可溶狀態(tài)的表達(dá)產(chǎn)物存在。

圖2 日本鰻鱺AjCathI氨基酸序列與其它已知Cathelicidin氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖3 pET-28a/AjCathI重組質(zhì)粒在不同誘導(dǎo)時間下的表達(dá)結(jié)果

圖4 重組表達(dá)pET-28a/AjCathI蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.5 重組蛋白表達(dá)的純化

為了得到AjCathI表達(dá)產(chǎn)物，將超聲破碎菌體收集的沉淀部分過鎳離子螯合親和層析柱，用咪唑洗脫螯合的融合蛋白，280 nm檢測紫外吸收曲線，可見到明顯的洗脫蛋白峰（圖5）。收集洗脫部分進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖6），兩個蛋白洗脫峰中均含有目的蛋白AjCathI。以6-His-tag單克隆抗體做Western blot 鑒定純化產(chǎn)物，結(jié)果（圖7）顯示為陽性條帶。

圖5 親和層析柱（IMAC）純化目的蛋白AjCathI

圖6 IMAC洗脫蛋白電泳

圖7 Western blot鑒定AjCathI

圖8 重組蛋白復(fù)性分析

2.6 重組蛋白的復(fù)性

通過黏度和濁度判斷蛋白復(fù)性效果，重組蛋白最終溶解于PBS溶液中，呈現(xiàn)透明狀態(tài)，說明復(fù)性成功。SDS-PAGE電泳（圖8）顯示均有目的條帶，說明蛋白復(fù)性過程中基本沒有發(fā)生降解和斷裂。

3 討論

Cathelicidin根據(jù)成熟肽二級結(jié)構(gòu)的不同分為以下四大類：第一類是α-螺旋結(jié)構(gòu)（如鼠的CRAMP）［10］；第二類是延伸螺旋結(jié)構(gòu)（如牛的indolicidin）［11］，一般含有大量的脯氨酸（13%-49%）和精氨酸（13%-33%）；第三類是環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如牛的bactenecin）［12］，這一類分子由于含有一個二硫鍵而形成環(huán)狀；第四類是β折疊結(jié)構(gòu)（如豬的protegrin1）［13］，這一類分子通常含有2-3個二硫鍵，這些分類結(jié)構(gòu)有利于抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合［14］?？咕念A(yù)測工具（http：//aps.unmc.edu/ AP/prediction/ prediction_main.php）分析AjCathI成熟肽含有疏水性氨基酸殘基蛋氨酸1個，丙氨酸2個，疏水性比例為10%，電荷為+11。DNAstar軟件分析，結(jié)果顯示整個成熟肽形成親水性很強(qiáng)的區(qū)域，AjCathI為親水性強(qiáng)陽離子抗菌肽，沒有α螺旋結(jié)構(gòu)，形成延伸和任意卷曲的可能性比較大。Garnier等［15］方法分析，AjCathI形成延伸結(jié)構(gòu)的比例為18%，任意卷曲的比例為82%。Geourjon等［16］方法分析，AjCathI形成延伸結(jié)構(gòu)的比例為16%，任意卷曲的比例為84%。Frishman等［17］方法分析，AjCathI形成任意卷曲的可能性為100%。該抗菌肽與以往的抗菌肽結(jié)構(gòu)有一定的差異，其是否在水溶液中形成任意卷曲結(jié)構(gòu)，而在與生物膜接觸時形成α螺旋結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步考證，因此抗菌作用機(jī)制還有待通過圓二色譜及定位圓二色譜法、固相核磁共振技術(shù)、中子衍射和X-光散射等技術(shù)進(jìn)一步研究。

目前，用于原核表達(dá)系統(tǒng)的基因工程載體主要分為非融合表達(dá)載體和融合表達(dá)載體，后者又以攜帶6×His Tag和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽（GST Tag）的載體應(yīng)用最為廣泛。本試驗選用了高效融合表達(dá)載體pET-28a，pET-28a為含有T7強(qiáng)啟動子的原核高效表達(dá)載體，可將目的序列插入多克隆位點，表達(dá)出目的蛋白，同時載體攜帶有6個His標(biāo)簽，便于后續(xù)的純化。在實驗中我們曾經(jīng)嘗試用pGEX-4T-1表達(dá)載體，通過控制培養(yǎng)條件，諸如IPTG濃度、培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)時間等來增加蛋白的表達(dá)量，但多次實驗證明了pGEX-4T-1質(zhì)粒無法表達(dá)重組蛋白。

誘導(dǎo)條件對重組蛋白的表達(dá)也有不同程度的影響，如IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、大腸桿菌起始濃度、培養(yǎng)基的組成、pH和溶解氧等。王沛珍［18］報道低溫16℃可以增加thanatin抗菌肽表達(dá)量和可溶性，同時誘導(dǎo)9 h為最佳誘導(dǎo)時間。Ramos等［19］報道將誘導(dǎo)溫度從37℃降到30℃可以增加滿月蛤（Lucina pectinata）rHbII的表達(dá)量。Ma等［20］報道在YT培養(yǎng)基中加入0.5%（w/v）的葡萄糖可以顯著增加adenoregulin抗菌肽的表達(dá)量。本實驗發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間對Cathelicidin蛋白的表達(dá)量有比較顯著的影響。AjCathI在溫度為42℃，誘導(dǎo)時間為7 h蛋白表達(dá)量最高。

在原核表達(dá)過程中導(dǎo)致包涵體形成的原因有很多［21-23］。本實驗最終得到目的蛋白是以包涵體的形式存在，包涵體存在也有優(yōu)點，如蛋白質(zhì)表達(dá)量高，可避免宿主細(xì)胞蛋白酶對目的蛋白降解，包涵體易從宿主細(xì)胞中純化，可避免毒性蛋白（如毒素蛋白）對宿主細(xì)胞的毒性等優(yōu)勢。洗脫目的蛋白的方法有兩種，一種是降低pH洗脫，降低pH值可以減弱組氨酸和鎳離子之間的作用力，從而對蛋白進(jìn)行洗脫，降低pH值洗脫不會在洗脫的蛋白中帶入高濃度的咪唑，但很可能引起目標(biāo)蛋白在等電點附近的沉淀。另一種方法是升高咪唑的濃度，競爭目的蛋白與Ni2+結(jié)合，從而洗脫蛋白。此方法簡單易行，但同時洗脫的目的蛋白含有高濃度的咪唑。此外，也有用咪唑和降低pH值相結(jié)合的方法進(jìn)行洗脫，Zhang等［24］先用60 mmol/L pH8.0的咪唑洗脫雜蛋白，再用pH4.0的緩沖液洗脫目的蛋白hepcidin。本實驗采用了一步咪唑洗脫方法，最終得到大量的AjCathI蛋白。包涵體復(fù)性的方法有很多，如稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性、層析柱復(fù)性、溫度跳躍式復(fù)性等。本實驗采用了透析復(fù)性，最終滅菌水溶解凍干的目的蛋白澄清，說明復(fù)性成功，SDS-PAGE電泳檢測蛋白完整性很好。

LL-37是人類唯一的Cathelicidin類抗菌肽，具有廣譜的抗菌活性、化學(xué)趨化性及促進(jìn)血管生成和傷口修復(fù)性等特點，致使許多學(xué)者采用不同的方法體外表達(dá)重組蛋白，包括采用GST和pET系列載體及不同的純化方法。馮云等［25］表達(dá)了GST-FALL-39（最開始推測的人類Cathelicidin成熟肽，其比LL-37多兩個氨基酸）抗菌肽，GST-FALL-39存在于菌體裂解液的上清中，通過凝膠4B柱及AU-PAGE得到高純度的蛋白。Moon等［26］應(yīng)用與馮云等相似的方法表達(dá)出GST-LL-37融合蛋白，并發(fā)現(xiàn)低溫30℃，及低IPTG濃度（0.1 mmol/L）可以顯著增加可溶性重組蛋白的產(chǎn)量。Li等［27］應(yīng)用pET32a載體也表達(dá)出可溶性的LL-37重組蛋白，應(yīng)用親和色譜和反相色譜去除硫氧還原蛋白及其它雜蛋白，得到含有6個His-tag的LL-37蛋白。魚類Cathelicidin如同哺乳動物一樣只有成熟肽部分具有抗菌活性。一些學(xué)者原核表達(dá)出Cathelicidin prodomain，再用彈性蛋白酶酶解重組蛋白，確認(rèn)出成熟肽序列。至今大西洋鱈魚、虹鱒、香魚Cathelicidin成熟肽已得到確認(rèn)，成熟肽均具有較強(qiáng)的抗菌活性。

4 結(jié)論

本研究克隆并表達(dá)了日本鰻鱺抗菌肽AjCathI。AjCathI的cDNA全長為 842 bp，編碼 189個氨基酸。將AjCathI基因克隆至pET-28a 載體，pET-28a/ AjCathI蛋白最佳表達(dá)條件為42℃，誘導(dǎo)7 h，并以包涵體形式存在。經(jīng)鎳柱純化、Western blot驗證和透析復(fù)性，最終獲得高純度的重組蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Prokaryotic Expression of Cathelicidin Gene from Japanese Eel I，Anguilla japonica

Zhang Dongling1Yu Dahui2
（1. Fisheries College，Jimei University，Engineer Research Center of Eel Modern Industry Technology，Ministry of Education，Xiamen 361021；2. South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300）

Cathelicidin， an utmost family of antibacterial peptide so far， possesses multiple biological functions. In order to explore and exploit the antibacterial mechanism and potential biological functions of Cathelicidin， full-length sequence of cDNA of Cathelicidin gene from Japanese eel Anguilla japonica I（AjCathI）was obtained by RACE-PCR. The full cDNA of AjCathI was 842 bp and the ORF contained 570 bp encoding 189 amino acids. Analysis of amino acid sequence demonstrated that AjCathI contained 4 conservative cysteine residues at C terminal，and the mature antibacterial peptide had the highest similarity with Plecoglossus altivelis by homology of 65.57%. Phylogenetic analysis revealed that AjCathI shared a common evolutionary origin with other teleost fishes. AjCathI was cloned into pET-28a and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The result manifested that AjCathI protein was expressed in inclusion bodies. The protein was isolated by Ni column， identified by Western blot and re-natured by dialysis， the protein of high purity was gained. This study laid the foundation for further verifying mature peptide sequence of AjCathI and studying its antibacterial activities as well as other biological functions.

Anguilla japonica；Cathelicidin；antibacterial peptide；RACE-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.018

2014-10-22

福建省教育廳重點項目（JA13171），集美大學(xué)李尚大學(xué)科建設(shè)基金項目（ZC2013003），集美大學(xué)鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心開放基金項目（ZK2013005）

張東玲，女，博士，講師，研究方向：水產(chǎn)動物免疫學(xué)；E-mail：donglingzhang@126.com

喻達(dá)輝，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種；E-mail：pearlydh@163.com