孫萬(wàn)虹 陳麗華 徐紅偉

（西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，蘭州 730030）

氮磷含量對(duì)微生物修復(fù)油污土壤的影響

孫萬(wàn)虹 陳麗華 徐紅偉

（西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，蘭州 730030）

以甘肅西峰市油田附近土壤中的土著微生物為菌源，富集培養(yǎng)、篩選分離得到 5 種菌屬的降解石油菌。通過(guò)向油污土壤中添加尿素、磷酸氫二銨的現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，歷時(shí)63 d。研究了氮、磷含量在由5種菌制得的混合菌劑對(duì)油污的降解中的影響。結(jié)果表明，人為增加土壤中氮、磷元素對(duì)混合微生物菌劑修復(fù)油污土壤具有顯著促進(jìn)效果。在含油量1.5%和3%的污染土壤中，氮、磷元素的變化表現(xiàn)為兩個(gè)階段，前28 d氮、磷含量迅速減少，后35 d氮、磷含量變化表現(xiàn)出波動(dòng)性，且在濃度為3%的污染土壤中，微生物菌劑的修復(fù)效果更為明顯，最大降油率達(dá)到52.5%。利用GC-MS測(cè)定分析混合菌劑對(duì)石油主要成分藿烷的降解程度和演化規(guī)律的研究表明，混合菌劑對(duì)油污土壤中霍烷類化合物的降解均在80%以上，降解率較高，其中最高的是芒柄花根烷，達(dá)到86.3%.

微生物修復(fù)；油污土壤；氮磷含量；藿烷

石油是一種復(fù)雜的混合物，主要含多種烷烴類、芳香烴、脂環(huán)烴等及少量其他的非烴類物質(zhì)［1］。在石油勘探、開(kāi)采、加工、存儲(chǔ)及運(yùn)輸過(guò)程中，不可避免地會(huì)使一些石油灑落地面，造成土壤污染。土壤受到石油烴污染后，其各方面性質(zhì)會(huì)發(fā)生一定程度的改變。石油污染物會(huì)對(duì)土壤孔隙造成堵塞，使土壤的滲水量和透水性下降［2］。石油污染物還會(huì)改變土壤中有機(jī)質(zhì)的碳氮比和碳磷比，從而引起土壤微生物群落、區(qū)系的變化，破壞整個(gè)土壤的微生態(tài)環(huán)境［3，4］。目前，治理油污土壤有多種方法，如焚燒法、固化法、熱脫附法、洗滌法、溶劑萃取法、生物法等［5］，而國(guó)內(nèi)外研究和運(yùn)用較多的處理技術(shù)是微生物修復(fù)和堆制處理。在堆置處理過(guò)程中配合投加高效原油降解菌和優(yōu)良營(yíng)養(yǎng)物能促進(jìn)原油的去除［6-8］。生物法主要是采用微生物處理技術(shù)［9-13］，即就地生物處理技術(shù)，利用微生物降解土壤中的原油等污染物，使其最終完全礦化。

影響油污土壤生物治理效率的因素很多，如微生物的種群構(gòu)成和馴化、油的化學(xué)組成和濃度、環(huán)境溫度及土壤酸堿度和鹽度等都會(huì)影響微生物降解的效果。只有將這些因素控制好，才能在實(shí)際治理中獲得預(yù)期的治理效率，而土壤中氮、磷的缺乏最可能成為微生物降解石油的限制因素［14］。研究結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)的不足或過(guò)量都會(huì)抑制微生物對(duì)有機(jī)污染物的生物降解，說(shuō)明加入氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量并不是越多越好，存在一個(gè)經(jīng)濟(jì)合理的添加量及添加比例［15］。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，以甘肅隴東地區(qū)含油土壤為菌源，以原油為唯一的碳源，經(jīng)過(guò)富集、分離篩選出5株石油降解菌，將其制成混合菌劑投加到現(xiàn)場(chǎng)油污土壤中。通過(guò)向隴東地區(qū)油田所采的石油污染土壤中添加氮、磷等元素，測(cè)定混合菌劑對(duì)油污土壤中石油的降解率，研究氮、磷含量對(duì)石油降解的影響。并通過(guò)GC-MS測(cè)定分析混合菌劑在7 d對(duì)石油主要成分藿烷類化合物的降解程度。

1 材料與方法

1.1 混合菌劑降解油樣

1.1.1 混合菌劑的篩選及制備 以甘肅隴東西峰市油田（西-27#原油）附近土壤中的土著微生物為菌源，以原油為唯一碳源進(jìn)行篩選分離，得到高效石油降解菌。經(jīng)大連寶生物工程有限公司鑒定分別為：A6菌株屬于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌屬，D4菌株歸屬于蒙氏假單胞菌（P. monteilii）菌屬，A5菌株屬于魯菲不動(dòng)桿菌（Acinetobacter lwoffii）菌屬，F(xiàn)1菌株屬于黃色類諾卡氏菌（Nocardioides luteus）菌屬，F(xiàn)2菌株屬暗黑微綠鏈霉菌（Streptomyces atrovirens）菌屬。

單個(gè)菌劑的培養(yǎng)采用的是三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)法，在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)平板稀釋法檢查菌落數(shù)大于1×1010個(gè)/mL后，制成菌液；培養(yǎng)細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，放線菌用改良高氏1號(hào)，霉菌用馬丁培養(yǎng)基。

1.1.2 混合菌劑降解油樣 將單菌菌液（按照A6+D4、A5、F1、F2菌的混合體積比約為5∶2∶2∶1配制）接入20 mL含10 mg原油的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角燒瓶，28℃搖床震蕩培養(yǎng)7 d，取出加入氯仿10 mL，放入超聲波儀器中破乳15 min，倒入滴液漏斗中萃取出氯仿相，如此反復(fù)3次，將萃取液收集一起，放入水浴中將氯仿蒸發(fā)殆盡，剩下的殘油準(zhǔn)確稱量后用正己烷（色譜純）定容至10 mL，即為GS-MC測(cè)試降解油樣。同時(shí)不添加混合菌劑設(shè)置對(duì)照組。

1.1.3 氮磷元素添加劑及膨松劑 用農(nóng)用尿素、磷酸氫二銨分別作為氮、磷元素的添加劑；用木材加工廠生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的鋸末，經(jīng)四十目篩篩選后作為膨松劑。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS分析條件及藿烷含量測(cè)定 GC-MS（Angilent 7890A/5975C）載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；DB-5MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL；尾吹流量10.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃，離子源溫度230℃；柱溫采用程序升溫，初溫40℃，保持8 min，在以10℃/min升至220℃，保持17 min，再以10℃/min升至290℃，保持10 min；離子化方程（EI），離子化能量70 eV。質(zhì)譜全掃描定性，掃描范圍：45-500 amu。

石油中藿烷類化合物的測(cè)定參照《環(huán)境中石油污染物的分析技術(shù)》（1987）中的氧化鋁層析柱法［16］，分離石油中的藿烷類化合物，用GC-MS解析藿烷各組分物質(zhì)，用質(zhì)量歸一法計(jì)算出樣品中藿烷各種化合物的含量。石油中藿烷類的降解率R計(jì)算方法如下：藿烷類化合物的降解率=（M1-Mi）/M1

式中：M1為第1天土壤中藿烷類物質(zhì)含量（mg·kg-1）；Mi為第i天土壤中藿烷類物質(zhì)含量（mg·kg-1）。

1.2.2 油泥中微生物數(shù)量分析 土壤中微生物數(shù)量測(cè)定采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法（CFU）［17］，微生物數(shù)量是土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量之和。微生物計(jì)數(shù)選用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和高氏一號(hào)培養(yǎng)基，分別用于細(xì)菌、真菌和放線菌的計(jì)數(shù)。測(cè)定方法：稱取10 g鮮土樣置于已滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶中，加入90 mL無(wú)菌水，振蕩10 min使土樣分散成為均勻的土壤懸液，對(duì)土壤懸液進(jìn)行梯度稀釋，取合適的稀釋度涂平板，一般好氧異養(yǎng)細(xì)菌采用10-4-10-6，放線菌采用10-3-10-5，真菌采用10-1-10-3稀釋度。將涂布均勻的平板倒置于30℃培養(yǎng)一定時(shí)間（細(xì)菌1-2 d，放線菌4-5 d，真菌3-4 d），進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

1.2.3 油污土壤中含油量測(cè)定 土壤中石油類物質(zhì)的測(cè)定采用紫外分光光度法［18］。用索式提取法提取土壤中石油類物質(zhì)，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)出相對(duì)應(yīng)的吸光度，計(jì)算每千克干土中石油類物質(zhì)含量。

1.2.4 土壤中總氮的測(cè)定方法 參照土壤全氮測(cè)定法（GB 7173-1987）。用濃硫酸消化分解，以甲基紅-溴甲酚綠為指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定至粉紅色為終點(diǎn)，根據(jù)鹽酸的用量，求出分析樣品中的含氮量。

1.2.5 土壤中有效磷的測(cè)定方法 參照石灰性土壤有效磷測(cè)定方法（GB 12297-1990）。用0.5 mol/L的NaHCO3作為浸沒(méi)劑處理土壤，在一定的酸度下，用硫酸鉬銻抗還原顯色成磷鉬藍(lán)，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.2.6 油污土壤現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)設(shè)計(jì) 在西峰27#油井旁的一塊試驗(yàn)田進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)田的面積為2×3 m2，深度為30 cm。首先將試驗(yàn)田中土壤進(jìn)行翻耕，邊翻耕邊按土量的8.3%添加鋸末?；旌暇鶆蚝髮⒃囼?yàn)田分為1.5%濃度和3%濃度兩塊區(qū)域。然后向1.5%濃度區(qū)和3%濃度區(qū)分別添加原油1.5 L和3 L，再按照C∶N∶P=100∶10∶1調(diào)整土壤中N、P的含量，向1.5%濃度區(qū)添加尿素3.36 kg，磷酸氫二銨0.70 kg；向3%濃度區(qū)添加6.73 kg，磷酸氫二銨1.47 kg，充分混合。最后投加40 L的混合菌劑。

將兩區(qū)域各均勻劃分為6塊小區(qū)域，再?gòu)膬蓚€(gè)區(qū)域中各隨機(jī)預(yù)選3塊小區(qū)域編號(hào)為1、2、3區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)。按0、7、14、28、21、28、35、49、63 d從試驗(yàn)田中分別取土樣，晾干后進(jìn)行油含量和氮磷含量的測(cè)定。現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)中，在第28天補(bǔ)充過(guò)一次氮磷，向低濃度區(qū)添加尿素0.50 kg，磷酸氫二銨0.10 kg；向高濃度區(qū)添加1.00 kg，磷酸氫二銨0.20 kg。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化特征

自西峰27#油區(qū)6個(gè)典型油泥收集點(diǎn)，采集4.770 kg的油污土壤，以及未受污染的背景土壤樣品18個(gè)，測(cè)定其礦物油、有效磷、總氮、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、pH、干物質(zhì)重量（含水率）、電導(dǎo)率、含油量及石油組分。測(cè)定結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 背景土壤基本信息

由于油田散布于黃土塬農(nóng)業(yè)區(qū)中，土壤中速效鉀是肥力的重要表征參數(shù)，總氮、有效磷、有機(jī)質(zhì)既是土壤肥力表征參數(shù)，又是油污土壤微生物降解所需氮源、磷源、碳源的背景土壤。從背景土壤理化值可以看出，隴東油區(qū)土壤含水率較低（小于5%）；pH在7.8 左右，為弱堿性，有利于微生物降解；總氮量較低，平均為0.493 g/kg，有機(jī)質(zhì)含量低，平均2.6%左右，土壤較為貧瘠；有效磷、速效鉀由于人工施肥背景值比荒地的高，但遠(yuǎn)低于微生物降解所需要的氮磷含量；電導(dǎo)率普遍小于1 mS/cm，表現(xiàn)出土壤鹽度低的特點(diǎn)。

從圖1可以看出，速效鉀、有效磷的含量隨含油率變化并未呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，可以說(shuō)速效鉀、有效磷的含量與含油率的大小關(guān)系不明顯。圖中含油土樣有效磷含量最小值為1.16 mg/kg，最大值為64.62 mg/kg，相差有近56倍，而其對(duì)應(yīng)的含油率為5.61%和3.97%，相差不到兩倍。同樣含油土樣速效鉀含量最小值為31.12 mg/kg，最大值為604.01 mg/kg，相差有近20倍，而其對(duì)應(yīng)的含油率為6.47%和3.97%，變化也不到兩倍。從圖中可以明顯地看出，速效鉀與有效磷含量的變化呈現(xiàn)出同增同減，具有較強(qiáng)的同步性。

圖1 速效鉀和有效磷含量與含油率變化關(guān)系

2.2 不同石油濃度土壤的現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)效果及微生物變化的關(guān)系

不同濃度實(shí)驗(yàn)區(qū)微生物數(shù)量和降解幅度之間的關(guān)系如圖2所示。高低濃度區(qū)（3%）微生物總數(shù)變化以35 d為界，在此之前，低濃度區(qū)（1.5%）微生物總數(shù)高于高濃度區(qū)，之后高濃度區(qū)的微生物總數(shù)大于低濃度區(qū)。這與第28天時(shí)對(duì)高濃度區(qū)進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充和菌劑的補(bǔ)加有關(guān)，說(shuō)明低濃度石油烴刺激了土壤中微生物的活動(dòng)，表現(xiàn)為數(shù)量增加，以降解外來(lái)污染物保持原有的平衡［19］。當(dāng)石油濃度為某一濃度范圍時(shí)，微生物數(shù)量和降解率會(huì)維持在較高的水平；當(dāng)石油濃度過(guò)高時(shí)，一些對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝具有毒性或抑制作用物質(zhì)的濃度達(dá)到閾值時(shí)就會(huì)大大抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，甚至?xí)⑺牢⑸锛?xì)胞，最終影響石油降解［20］。另外，高濃度的石油也會(huì)影響培養(yǎng)基的溶氧速度，使微生物缺氧，對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的利用也產(chǎn)生阻礙作用，從而影響了微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。由此可見(jiàn)，油質(zhì)量濃度對(duì)微生物降解石油烴有明顯的影響。

微生物對(duì)油污土壤的降解率隨微生物數(shù)量變化呈現(xiàn)出相似變化趨勢(shì)，在前兩周降解率高，降解幅度達(dá)到32.86%，第3周降解幅度逐漸降低至8.33%，在35 d左右降解率提高，降解幅度增加為17%后降解率呈下降趨勢(shì)，降至2.06%，可見(jiàn)微生物數(shù)量跟降解率成正比。后期降解率趨于平緩可能跟培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)系。另外微生物對(duì)不同類型石油烴的降解能力不同，則各類石油烴被微生物降解的速率存在一定的差異［21］。

圖2 微生物數(shù)量與降解幅度之間的關(guān)系

2.3 氮、磷含量對(duì)降解油污土壤的影響

氮磷含量和降油率隨時(shí)間變化情況如圖3所示。降油率隨著氮、磷的降低而增加，氮磷含量的變化與降油率存在反比關(guān)系。氮、磷含量消耗的非常迅速。僅在第一個(gè)試驗(yàn)周期，1.5%和3%兩個(gè)濃度區(qū)的氮消耗率都較大，而磷含量的變化相對(duì)較小，充分說(shuō)明微生物菌劑對(duì)氮元素的需求量遠(yuǎn)大于對(duì)磷的需求量。氮消耗相對(duì)較小的另一個(gè)原因在于：試驗(yàn)田區(qū)第一周并未降雨和人工灌溉，致使磷的損失很少，而氮的揮發(fā)損失較多，致使氮消耗量比磷大。而在前28 d，土壤中的油含量迅速減少，在28 d達(dá)到最低值，降油率達(dá)到最大，之后進(jìn)入一個(gè)波動(dòng)期。這說(shuō)明在1.5%和3%的油污土壤中按C∶N∶P=100∶10∶1添加氮磷元素，對(duì)微生物修復(fù)作用的促進(jìn)效果非常明顯?？赡苁腔旌暇鷦┰谟谐渥愕牡⒘讈?lái)源時(shí)，降油能力明顯提升，能迅速大量地分解土壤中的石油，同時(shí)土壤中碳、氮、磷等元素因大量消耗而減少。

從圖3中也可以明顯看出，3%濃度區(qū)氮含量的消耗速率遠(yuǎn)大于1.5%濃度區(qū)，這可能是3%濃度區(qū)尿素和磷酸氫二銨的添加量比1.5%濃度區(qū)大，致使揮發(fā)損失量相對(duì)較大。在試驗(yàn)的第35天，氮、磷含量變化進(jìn)入一個(gè)新的消耗階段，此階段氮、磷的消耗速率比前28 d小且呈現(xiàn)出很大波動(dòng)性。產(chǎn)生這種情況的可能原因是，代謝產(chǎn)物大量積累對(duì)微生物菌體產(chǎn)生毒害致使部分微生物死亡，而被微生物所固定的氮、磷元素重新釋放到土壤中。

圖3 氮磷含量與降油率變化關(guān)系圖

2.4 混合菌劑對(duì)藿烷降解特性

石油是以鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴以及少量非烴類化合物為主要成分的復(fù)雜混合物。微生物降解就是微生物利用石油烴類作為碳源和能源，經(jīng)過(guò)一系列氧化、還原、分解、合成等生化作用，將石油污染物最終礦化轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害的CO2和H2O的過(guò)程。藿烷類化合物是石油中常見(jiàn)的生物標(biāo)志物。藿烷不是由生物體直接合成，而是由死亡生物體經(jīng)地球化學(xué)過(guò)程演化而來(lái)。在成巖過(guò)程中藿烷類化合物由生物構(gòu)型（R型）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈刭|(zhì)構(gòu)型（S型），最后達(dá)到S型與R型的平衡狀態(tài)［S/（S+R）=0.6］。

以原油為唯一碳源和能源，經(jīng)混合菌劑對(duì)其進(jìn)行 7 d 的培養(yǎng)基降解，藿烷降解情況如圖4所示。對(duì)圖4的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，結(jié)果如圖5所示，混合菌劑對(duì)油污土壤中藿烷類化合物的降解率都在80%以上，降解幅度較高，說(shuō)明藿烷的手性碳向穩(wěn)定構(gòu)型S型轉(zhuǎn)化?；旌暇鷦┙到饴首罡叩氖敲⒈ǜ?，降解率高達(dá)86.3%。而對(duì)γ-蠟烷、17α（H）21β（H）-22S-31，32-二升藿烷、17α（H）21β（H）-22R-31，32-二 升 藿 烷、17α（H）21β（H）-22S-31，32，33-三升藿烷、17α（H）21β（H）-22R-31，32，33-三升藿烷、17α（H）21β（H）-22S-31，32，33，34-四升藿烷、17α（H）21β（H）-22S-31，32，33，34，35-五升藿烷的降解率都在85%以上?？梢?jiàn)在合適的氮磷配比下，該混合菌劑對(duì)油污土壤中的藿烷類化合物降解率較高，原油和混合菌劑作用7 d的原油的藿烷系列碳數(shù)分布相同均為C27-C35（C28缺失），主峰相同均為C30-αβ藿烷。由表3可以看出，原始油樣C31-αβ-22S/22（S+R）和C32αβ-22S/22（S+R）比值分別為0.591和0.577，接近轉(zhuǎn)化終點(diǎn)值0.600，所以原石油樣為成熟質(zhì)，受外力作用變化不會(huì)很大。經(jīng)混合菌7 d降解后樣品的C31-αβ-22S/22（S+R）和C32αβ-22S/22（S+R）比值均大于原始油樣值，說(shuō)明混合菌劑能促使五環(huán)三萜類化合物的手性碳R構(gòu)型向更穩(wěn)定的S構(gòu)型轉(zhuǎn)化，短期內(nèi)就可以達(dá)到轉(zhuǎn)化終點(diǎn)。

w（Ts）/w（Tm）比值是石油地質(zhì)領(lǐng)域常用的有機(jī)質(zhì)演化程度參數(shù)，Ts為18α（H）22，29，30三降藿烷，Tm為17α（H）22，29，30三降藿烷。在生物體原生質(zhì)中只有Tm構(gòu)型而沒(méi)有Ts構(gòu)型，當(dāng)這類生物進(jìn)入地質(zhì)體后，在熱、微生物、壓力及礦物催化作用下三降藿烷將由Tm立體構(gòu)型逐漸向更穩(wěn)定的 Ts 立體構(gòu)型轉(zhuǎn)化，因而w（Ts）/w（Tm）比值越大既反映了有機(jī)質(zhì)受外作用力的程度越強(qiáng)。而在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)添加菌劑提供外作用力，可見(jiàn)w（Ts）/w（Tm）比值越大則說(shuō)明菌劑對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解越強(qiáng)烈。

圖4 降解后藿烷離子流圖

圖5 混合菌劑降解油樣藿烷組分及降解率

3 討論

從背景土壤理化特性可以看出，隴東黃土原油區(qū)土壤以黃綿土為主，土壤中石英的含量最大，約為37%-57%，透水性強(qiáng)，有機(jī)質(zhì)含量低。由于油田作業(yè)區(qū)許多分散在農(nóng)業(yè)用地上，油污土壤人為施加過(guò)氮、磷等肥料，土樣中氮、磷含量相對(duì)較高，且同一樣品中的速效鉀、有效磷含量具有很強(qiáng)的一致性；有機(jī)質(zhì)含量在整體趨勢(shì)上隨含油率的增大而增大。

對(duì)1.5%和3%兩個(gè)不同濃度區(qū)油污土壤進(jìn)行對(duì)比分析研究表明，按C∶N∶P=100∶10∶1添加氮、磷元素后，1.5%濃度區(qū)石油降解達(dá)到最大值的時(shí)間短，且降解效果不佳，在第3周便達(dá)到降油率的最大值，降解率最大為49.35%。而3%濃度區(qū)試驗(yàn)降解率達(dá)到最大值的時(shí)間分別為28 d、49 d和49 d，降解率最大為73.29%。這說(shuō)明按C∶N∶P=100∶10∶1添加氮、磷元素能延長(zhǎng)微生物對(duì)石油降解的時(shí)間，且對(duì)3%濃度區(qū)石油的降解比1.5%濃度區(qū)石油的降解促進(jìn)效果更為明顯。

在兩個(gè)不同濃度區(qū)油污土壤中，氮、磷含量變化趨勢(shì)基本一致，存在個(gè)別差異的可能原因有：（1）使微生物菌劑能夠及時(shí)利用的氮、磷含量稍有不同；（2）土壤的濕度、土壤空隙的飽和度、pH等因素對(duì)微生物的活性影響不同，從而使利用氮、磷元素的效率存在差異；（3）各試驗(yàn)組氮、磷損失存在細(xì)微差異。

從混合菌劑對(duì)藿烷的降解參數(shù)可以看出，混合菌劑降解石油的w（Ts）/w（Tm）比值大于原始油樣的值，表明該混合菌劑可促使五環(huán)三萜類化合物立體不穩(wěn)定構(gòu)型向穩(wěn)定性構(gòu)型轉(zhuǎn)化。且菌劑在短期內(nèi)對(duì)藿烷的降解就較明顯。從表3中w（∑藿烷）/w（∑正構(gòu)烷烴）比值可看出，混合菌劑的比值明顯小于原始油樣的0.394，表明混合菌劑作用原油時(shí)藿烷的降解速率明顯大于正構(gòu)烷烴系列。

表3 藿烷降解組分演化分析

4 結(jié)論

對(duì)含油量為1.5%和3%左右的油污土壤63 d微生物修復(fù)過(guò)程中，氮、磷元素的變化以28 d為界限存在兩個(gè)明顯的階段，前28 d氮、磷含量迅速減少，后35 d氮、磷含量變化表現(xiàn)出波動(dòng)性。

不同濃度實(shí)驗(yàn)區(qū)微生物總數(shù)變化以35 d為界，35 d之前，低濃度區(qū)微生物總數(shù)高于高濃度區(qū)，而之后高濃度區(qū)的微生物總數(shù)大于低濃度區(qū)。降解幅度隨時(shí)間的變化規(guī)律微生物總數(shù)的變化規(guī)律相一致。

西峰長(zhǎng)慶油田區(qū)油污土壤中氮、磷含量水平很低，不利于微生物修復(fù)。按C∶N∶P=100∶10∶1人為添加氮、磷物質(zhì)對(duì)混合微生物菌劑修復(fù)石油污染的土壤促進(jìn)效果明顯，高低濃度區(qū)最大降油率平均分別達(dá)到52.5%和33.44%，因此，人為添加氮、磷物質(zhì)對(duì)高濃度的油泥的微生物修復(fù)效果促進(jìn)作用更為明顯。

混合菌劑對(duì)油污土壤中藿烷類化合物的降解均在80%以上，降解率較高，其中最高的是芒柄花根烷，達(dá)到86.3%；w（Ts）/w（Tm）比值說(shuō)明藿烷的降解表現(xiàn)出手性碳由R型向穩(wěn)定構(gòu)型S型轉(zhuǎn)化的特征。w（∑藿烷）/w（∑正構(gòu)烷烴）比值可看出，混合菌劑的比值明顯小于原始油樣的0.394，表明混合菌劑對(duì)藿烷的降解速率較快。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of Nitrogen and Phosphorus Contents on the Oil Degradation Rate

Sun Wanhong Chen Lihua Xu Hongwei
（Experimental Center of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030）

Five oil-degradation bacterial strains were cultured， isolated and screened from soil at Xifeng Oilfield of Gansu Province，northwestern China. On-site experiments by adding different levels of urea and ammonium dibasic phosphate to oil-contaminated soil lasted 63 d， the effects of nitrogen and phosphorus contents on the oil degradation rate by mixed bacterial agent from 5 strains were investigated. The results reveal that nitrogen and phosphorus contents in oil-contaminated soil of Xifeng Oilfield are in low level， and it is not conducive for bioremediation；however， artificially adding a certain amount of nitrogen and phosphorus for bioremediation of oil-contaminated soil with mixed bacterial agent have significant promoting effects. The changes of nitrogen and phosphorus show two stages in the 63 d microbial remediation process for 1. 5% and 3% oil-contaminated soil：the contents of nitrogen and phosphorus decrease rapidly in the first stage（0-28 d）；while they fluctuate after 35 d. The microbial remediation effect for the 3% oil-contaminated soil is obvious， and the maximum oil-degradation rate reaches 52. 5%. GS-MC was used to measure and analyze the degradation rate and evolution pattern of mixed bacterial agent for hopane - the major constituent of oil. The results show that， in the optimal ratio of nitrogen to phosphorus， the degradation rate of mixed bacterial agent for hopane-like compounds in the oil-contaminated soil is over 80%， the highest degradation rate（86. 3%）for onocerane.

microbial remediation；oil-contaminated soil；nitrogen and phosphorus content；hopane

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.025

2014-08-28

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（41361070），中石油長(zhǎng)慶油田分公司項(xiàng)目（14AQ-KF-011），2014年甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（145RJZA224），2013年西北民族大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助

孫萬(wàn)虹，女，博士，副教授，研究方向：土壤石油污染機(jī)理與修復(fù)；E-mail：sunwh2004@126.com

陳麗華，女，博士，教授，研究方向：土壤石油污染機(jī)理與修復(fù)；E-mail：clh@xbmu.edu.cn