陳宇豐柯春亮周登博高祝芬戚春林張錫炎

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

香蕉根際土壤解鉀放線菌的篩選鑒定及解鉀特性研究

陳宇豐1，2柯春亮2周登博2高祝芬2戚春林1張錫炎2

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

旨在根據(jù)解鉀菌的解鉀特性和機(jī)理，從香蕉根際土壤中分離獲得解鉀能力較強(qiáng)且十分穩(wěn)定的高效解鉀放線菌。首先，通過解鉀分離培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基的初篩，獲得一批高效解鉀菌，然后在實(shí)驗(yàn)室條件下鑒定菌株類型和測定解鉀率，得到一株高效解鉀放線菌。最后通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA基因序列分析對(duì)所篩菌株進(jìn)行鑒定，并測定不同條件下的解鉀率，對(duì)其解鉀特性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，從香蕉根際土壤中篩選出16株高效解鉀菌，通過鑒定和解鉀率的測定，最終獲得一株穩(wěn)定的解鉀鏈霉菌（Streptomycete）M3-4，其在120 h，30℃，pH為6，鉀長石粉為5 g，搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min條件下，以麥芽糖為碳源，蛋白胨為氮源時(shí)解鉀率達(dá)最大值。該菌株為陜西鏈霉菌（Streptomyces shaanxiensis），解鉀率約為20%。

香蕉根際土壤；放線菌；解鉀率

鉀是土壤中含量最高的營養(yǎng)元素［1］，在地殼礦質(zhì)元素中居第7位，在巖石圈中排名第4位［2］，其對(duì)植物的新陳代謝和生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，主要參與細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、物質(zhì)運(yùn)輸，促進(jìn)酶的活化、氮素的利用、蛋白質(zhì)和糖類的合成，以及增強(qiáng)植物的光合作用［3］。土壤中鉀元素一般可分為水溶性鉀、交換性鉀、非交換性鉀和礦物質(zhì)鉀，能直接被植物吸收利用的有效鉀約占總量的2%［4］，有95%的鉀以緩效態(tài)形式存在于鉀長石或云母等硅酸鹽礦物中，不能被植物直接吸收利用［5］。

研究表明，土壤中分布著大量的功能微生物［6，7］，解鉀菌便是從土壤中分離出的一類能利用鋁硅酸鹽和磷灰石類礦物的細(xì)菌，通過分泌低分子量有機(jī)酸，能快速溶解以云母、伊利石、鉀長石等鉀礦石形式存在的鉀或通過鰲合硅離子將鉀離子釋放到土壤中［8］。利用解鉀微生物可以增加土壤中有效鉀離子的含量，促進(jìn)作物生長發(fā)育，提高產(chǎn)量［9］。

研究表明，解鉀菌是常用的促生根際菌（PGPR）之一，通過在植物根際定殖，促進(jìn)植物生長、提高產(chǎn)量和營養(yǎng)利用率［10，11］。當(dāng)前解鉀細(xì)菌主要以Bacillus mucilaginosus、Bacillus edaphicus和 Pseudomonas sp.為主［12-14］，趙飛等［15］篩選到35株解鉀細(xì)菌；羅華元等［16］篩選了1株高效解鉀側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus lateraporus）。此類解鉀細(xì)菌解鉀能力不強(qiáng)，且在生產(chǎn)應(yīng)用上也不穩(wěn)定，而土壤中的放線菌，極少具有解鉀功能，目前對(duì)土壤中的解鉀放線菌研究較少。為緩解鉀肥短缺的現(xiàn)狀和開發(fā)新一代穩(wěn)定的解鉀細(xì)菌，本研究以鉀長石粉為唯一鉀源的硅酸鹽選擇性培養(yǎng)基，利用梯度稀釋分離法和平板劃線法從香蕉根際土壤中分離出16株解鉀細(xì)菌，并通過分離純化、發(fā)酵培養(yǎng)和對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液中速效鉀的測定，得到一株解鉀能力較強(qiáng)的放線菌M3-4，研究該解鉀菌的生理生化特征和對(duì)鉀長石粉的解鉀特性，培養(yǎng)時(shí)間、pH、溶氧量和鉀長石粉量對(duì)解鉀能力的影響，旨在了解解鉀鏈霉菌的生長習(xí)性和解鉀機(jī)理，為開辟新的效果好、成本低且不污染環(huán)境的解鉀菌，充分利用土壤中的鉀素資源提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟(jì)的綠色農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 土樣8份，采自海南省臨高縣南寶鎮(zhèn)（10951'17"E，1947'1"N）、美臺(tái)鎮(zhèn)（109 35'58"E，1940'51"N）、皇桐鎮(zhèn)（10950'58"E，19 49'58"N）香蕉園健康植株根際土壤。采集后置于無菌封口袋中混勻、封口，于冰盒中保存。土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，除去根系、石塊等雜物，于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，NaCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，CaCO35.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL，pH7.2。

篩選培養(yǎng)基：蔗糖5 g，Na2HPO42 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl30.005 g，CaCO30.1 g，土壤礦物1 g，瓊脂18-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.5。

營養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，pH7.2-7.5。

1.2 方法

1.2.1 解鉀菌的分離篩選

1.2.1.1 初篩 稱取10 g新鮮土壤樣品，溶于100 mL無菌水中，利用磁力攪拌器充分混勻制成懸液，再用10倍稀釋法進(jìn)行稀釋處理，分別配制10-4、10-5和10-6的土壤懸液，吸取0.1 mL懸液涂布至分離培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，28℃倒置培養(yǎng)3-4 d，待細(xì)菌菌落長出后進(jìn)行四分體劃線純化。

1.2.1.2 復(fù)篩 將純化后的菌株轉(zhuǎn)接至以鉀長石為唯一鉀源的篩選培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4 d，用四苯硼鈉（1%四苯硼鈉+2% 氫氧化鉀）覆蓋平板，并加入0.04%的溴酚藍(lán)顯色，觀察菌落周圍出現(xiàn)亮藍(lán)色的菌株，初步定為解鉀細(xì)菌，純化后保存于細(xì)菌營養(yǎng)培養(yǎng)基斜面上。

1.2.2 解鉀菌的分類鑒定

1.2.2.1 形態(tài)與培養(yǎng)特征觀察 采用國際鏈霉菌規(guī)劃中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基［17］，28℃培養(yǎng)7-21 d，觀察菌株培養(yǎng)特征，包括生長情況、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲特征等；酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基上取滅菌的蓋玻片以45角斜插入劃線處，28℃培養(yǎng)7-21 d，觀察蓋玻片上氣生菌絲、孢子絲及孢子形狀。

1.2.2.2 生理生化特征 參照Shirking與Gottlieb［18］的方法對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.2.3 細(xì)胞壁化學(xué)成分分析 快速薄板層析法［19］對(duì)菌株進(jìn)行細(xì)胞壁氨基酸、全細(xì)胞水解液糖型分析。

1.2.2.4 16S rDNA序列分析 選用細(xì)菌16S rDNA 通用 引 物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）建立PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，DNA模板2.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)純化后測定基因序列；采用EzTaxon與GenBank搜索序列相似性，選取相似性較高的模式菌株序列，用MEGA5.05中Neighbor-Joining法比較同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 解鉀菌解鉀能力測定 將篩選獲得的解鉀菌在營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h后，接種于無菌水中，充分震蕩搖勻，制成懸液。配制解鉀培養(yǎng)液（無鉀），按50 mL分裝于加入有5 g鉀長石粉的250 mL三角瓶中，121℃滅菌25 min后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解鉀率的影響 將菌株懸液按1%的接種量接種于上述無鉀培養(yǎng)液中，28℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120、144和168 h取樣，以不接菌處理為對(duì)照，測定速效鉀含量。

1.2.3.2 培養(yǎng)液pH對(duì)解鉀率的影響 分別配制pH為3、4、5、6、7、8和9共7個(gè)梯度的無鉀培養(yǎng)液，培養(yǎng)液其他成分不變。將菌株懸液按1%的接種量接入配制好的無鉀培養(yǎng)液，28℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后取樣，以不接菌處理為對(duì)照，測定不同pH條件下培養(yǎng)液速效鉀含量。

1.2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)解鉀率的影響 將上述無鉀培養(yǎng)液按1%的接種量接入菌株懸液，28℃分置于50、100、150、200、250和300 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)120 h后取樣，以不接菌處理為對(duì)照，測定速效鉀含量。

1.2.3.4 鉀長石粉量對(duì)解鉀率的影響 將上述無鉀培養(yǎng)液按50 mL分裝于250 mL三角瓶中，并按0.5、1、2、3.5、5、7.5和10 g的梯度量分別加入鉀長石粉，121℃滅菌25 min，按1%的接種量接入菌株懸液，28℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后取樣，以不接菌處理為對(duì)照，測定速效鉀含量。

1.2.3.5 不同碳氮源對(duì)解鉀率的影響 在上述無鉀培養(yǎng)液中，分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉及麥芽糖為碳源，以氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鈉、酵母膏及蛋白胨為氮源，培養(yǎng)液其他成分不變，按1%的接種量接入菌株懸液，28℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后取樣，以不接菌處理為對(duì)照，測定速效鉀含量。

1.2.3.6 不同溫度對(duì)解鉀率的影響 將上述無鉀培養(yǎng)液按1%的接種量接入菌株懸液，分置于溫度為24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃和36℃，轉(zhuǎn)速為250 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)120 h后取樣，以不接菌處理為對(duì)照，測定速效鉀含量。

1.2.3.7 測定方法 將以上培養(yǎng)液樣品全部倒入蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上濃縮至10 mL左右，加入4 mL H2O2繼續(xù)蒸發(fā)，直至黏稠物質(zhì)完全消失，4℃ 4 000 r/min離心10 min，收集上清液至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。在火焰原子吸收光度計(jì)上測定速效鉀含量，并設(shè)置未接菌處理為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，按以下公式計(jì)算菌株對(duì)鉀長石粉的解鉀率：

其中，a為培養(yǎng)液中鉀含量（mg/L），b為對(duì)照中鉀含量（mg/L），c為鉀長石粉量（g），d為全鉀含量（%）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel2007和SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果

2.1 解鉀菌的篩選

對(duì)土壤樣品進(jìn)行涂布處理，初步得到菌株248株，經(jīng)過一系列的分離和初篩，得到具有高效解鉀能力的菌株共16株，通過制備無鉀培養(yǎng)液，發(fā)酵液的處理采用過氧化氫灰化法［21］。并在火焰原子吸收分光光度計(jì)上測量解鉀量，由表1可知，16株解鉀菌的解鉀能力均較強(qiáng)，解鉀率基本都在10%以上，高于對(duì)照。其中M3-4菌株培養(yǎng)液中速效鉀含量最高，解鉀能力最強(qiáng)，解鉀率顯著高于其他菌株，本實(shí)驗(yàn)以M3-4菌株為研究對(duì)象，對(duì)其生理生化特性和解鉀特性做進(jìn)一步研究。

2.2 解鉀菌M3-4的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 圖1顯示，電鏡下，菌株M3-4的基內(nèi)菌絲彎曲呈樹根狀、不斷裂；氣生菌絲多分枝；孢子絲較長且直、呈柔曲形；孢子呈橢圓形，表面光滑。

表1 解鉀菌M3-4對(duì)鉀長石粉的解鉀率

圖1 菌株M3-4的孢子絲形態(tài)（A）及孢子形態(tài)（B）

2.2.2 培養(yǎng)特征 解鉀菌M3-4在8種供試培養(yǎng)基上生長良好，其菌落形態(tài)，見表2。

表2 菌株M3-4的培養(yǎng)特征

2.2.3 生理生化特征 菌株M3-4，生長pH范圍為3.0-9.0，最適生長pH為7.0；最適生長溫度為28-32℃；不能生長在NaCl含量大于5%的培養(yǎng)基上；其他生理生化特征，見表3。

表3 菌株M3-4的部分生理生化特征

2.2.4 細(xì)胞壁化學(xué)成分分析 薄板層析結(jié)果表明，菌株M3-4細(xì)胞壁中含有LL-DAP和甘氨酸，全細(xì)胞水解物無特征性糖，糖組分模式為C型，屬于細(xì)胞壁Ⅰ型放線菌。

2.2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹及同源性分析 菌株M3-4經(jīng)16S rDNA測序獲得1 430 bp的基因片段，將序列信息提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，以EzTaxon與GenBank進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)。結(jié)果顯示，菌株M3-4與鏈霉菌屬（Streptomyces）同源性均很高，歸為鏈霉菌屬。從16S rDNA 序列相似性比較分析來看，該菌株與深藍(lán)鏈霉菌（Streptomyces cyaneus）、古臘科鏈霉菌（Streptomyces curacoi）、陜西鏈霉菌（Streptomyces shaanxiensis）、青藍(lán)鏈霉菌（Streptomyces caeruleatus）、 林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）等菌株比較靠近，相似率均在99.5%以上。選取34株同源性較高的鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，與待測菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株M3-4與Streptomyces cyaneus和Streptomyces shaanxiensis親緣關(guān)系最近，相似率均達(dá)100%。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹相似性和同源性分析，其與Streptomyces shaanxiensis位于同一大分支，且進(jìn)化關(guān)系和距離最近，再結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征，鑒定此菌株為Streptomyces shaanxiensis，編號(hào)為M3-4。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株M3-4的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 解鉀菌M3-4對(duì)鉀長石粉的解鉀動(dòng)態(tài)研究

解鉀菌M3-4對(duì)難溶性鉀礦石的解鉀作用，除了與菌株本身的遺傳特性和難溶性鉀礦石的種類、成分有關(guān)外，還與培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)液的pH、難溶性鉀礦石的含量、溶解氧和碳氮源種類密切相關(guān)。

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響 由圖3可知，在168 h內(nèi)，菌株M3-4對(duì)鉀長石的解鉀能力隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化差異性顯著。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，解鉀率總體呈上升趨勢，從24 h 8.65%的解鉀率線性上升，在120 h升至峰值，解鉀率達(dá)到29.73%，顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間（P＜0.05）。在120 h之后，144 h和168 h的解鉀率略有下降，平均降低約4.5%，解鉀率分別為25.38%和24.23%，二者差異不顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，菌株M3-4培養(yǎng)到第5 天時(shí)解鉀率最高，解鉀能力最強(qiáng)，在5 d以后雖基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，但總體來說，在代謝產(chǎn)物的影響下，其解鉀能力略有降低。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響

2.3.2 pH對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響 由圖4可知，在不同pH條件下，菌株M3-4的解鉀能力差異性顯著。 pH從3-9，隨著pH值的逐漸增大，解鉀率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。以pH6的解鉀率最高，達(dá)到了29.99%，比pH3時(shí)升高了17.37%，差異十分顯著。在pH6之后，解鉀率開始顯著降低，在pH9時(shí)降至最低值，解鉀率變?yōu)?9.46%。縱觀整體，以pH為5和7次之，解鉀率略低于pH6時(shí)的解鉀率，分別為27.51%和27.21%，且兩者無顯著性差異。結(jié)果表明，pH值顯著影響菌株M3-4的解鉀率。菌株M3-4最適宜生長的pH環(huán)境為微酸性或中性，此研究對(duì)該菌株的培養(yǎng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有十分重要的意義。

圖4 pH值對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響 由圖5可知，不同溶解氧顯著影響菌株M3-4的解鉀能力。以50 r/min為搖速間隔，從50 r/min開始，隨著搖速的不斷增大，M3-4的解鉀率呈線性增長的趨勢，在250 r/min時(shí)達(dá)到平衡狀態(tài)。以250 r/min和300 r/min為峰值，解鉀率分別為29.95%和30.03%，兩者無顯著性差異，基本保持恒定。結(jié)果表明，菌株M3-4的發(fā)酵培養(yǎng)最理想的搖速應(yīng)為250 r/min，在此溶解氧范圍內(nèi)，該菌株可以正常的生長和新陳代謝，且解鉀能力也處于最強(qiáng)狀態(tài)。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速條件對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響

2.3.4 鉀長石粉量對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響 由圖6可知，鉀長石粉量對(duì)解鉀菌M3-4的解鉀能力有顯著性影響。隨著鉀長石粉量的增加，菌株的解鉀能力顯著升高。以0.5-5 g之間的增長最顯著，每個(gè)梯度平均增長3%。鉀長石粉為5 g時(shí)，解鉀率達(dá)到了28.76%，基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，隨著鉀長石粉量的增加，解鉀率變化微乎其微。而以鉀長石粉量為7.5 g和10 g時(shí)解鉀率最高，分別為29.44%和29.52%，兩者差異不顯著。結(jié)果表明，不溶性鉀礦石含量越高，該菌株活性越大，此研究對(duì)菌株的應(yīng)用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。

圖6 鉀長石粉量對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響

2.3.5 碳氮源對(duì)解鉀菌M3-4解鉀能力的影響 由圖7可知，不同碳氮源對(duì)菌株M3-4的解鉀能力影響差異顯著，以麥芽糖為碳源，蛋白胨為氮源時(shí)培養(yǎng)液速效鉀含量最高，菌株M3-4的解鉀率最大，分別為30.08%和29.99%；而以淀粉和酵母膏為碳氮源解鉀能力次之，其解鉀率分別為29.97%和29.67%，與兩個(gè)峰值無顯著性差異（P＜0.05）。以葡萄糖和氯化銨為碳氮源解鉀能力最低，解鉀率分別為19.15%和10.74%。結(jié)果表明，該解鉀菌株對(duì)碳源的利用以雙糖和多糖為主，利用效率優(yōu)于單糖。對(duì)氮源的利用以有機(jī)氮為主，有機(jī)氮利用效率優(yōu)于無機(jī)氮。

圖7 碳氮源對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響

2.3.6 溫度對(duì)解鉀菌M3-4解鉀能力的影響 由圖8可知，溫度對(duì)菌株M3-4的解鉀能力影響差異性顯著。 溫度在24℃-36℃區(qū)間，隨著溫度的不斷升高，解鉀率呈先升高后降低的趨勢。在30℃時(shí)達(dá)最大值，解鉀率為29.96%，溫度在24℃-30℃，解鉀率隨著溫度的升高增長迅速，梯度間差異十分顯著。在30℃-36℃，解鉀率隨著溫度的降低減小緩慢。而在28℃和32℃時(shí)，菌株解鉀率略低于最大值，分別為28.09%和27.58%，兩者無顯著性差異。結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度在28℃-32℃時(shí)，菌株M3-4的解鉀率最大，該研究可有利指導(dǎo)菌株M3-4的培養(yǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)。

圖8 溫度對(duì)解鉀菌M3-4解鉀率的影響

3 討論

解鉀菌又稱硅酸鹽細(xì)菌（Silicate bacteria），是一類能夠分解鉀長石、云母等硅酸鹽類礦物，把土壤中的固態(tài)鉀分解、轉(zhuǎn)化成為可以被作物直接吸收的有效鉀和分泌一些促進(jìn)植物生長的活性物質(zhì)的微生物［21］。土壤中含有大量的解鉀微生物［22］，大多數(shù)解鉀細(xì)菌都是從土壤中分離獲得，特別是從作物根際土壤中更容易分離獲得高效解鉀菌［23］。張朝輝等［24］從煙草根際分離一株解鉀菌；吳凡等［25］從桑樹根際土壤中分離獲得7株高效解鉀菌株。國內(nèi)外研究表明，目前發(fā)現(xiàn)的解鉀菌多為Bacillus sp.和Pseudmonas sp.，特別是膠質(zhì)芽孢桿菌B. mucilaginosus和克霍爾德菌（Burkholderia sp.）研究最為廣泛［26-28］，如Sugumaran 等［26］和Mikhailouskaya等［29］研究，而有關(guān)香蕉根際解鉀菌的報(bào)道很少。本研究是對(duì)香蕉根際土壤進(jìn)行試驗(yàn)分析，從香蕉根際土壤中分離得到16株高效解鉀菌，其中有10株為高效解鉀放線菌，系屬鏈霉菌屬，是解鉀菌類稀有微生物，目前尚無該類解鉀菌的報(bào)道和研究。其他6株為芽孢桿菌是植物根際土壤中最常見的細(xì)菌，解鉀能力和活性明顯低于10株放線菌。

本研究通過解鉀率的測定，選用其中一株解鉀活性最大的放線菌M3-4菌株進(jìn)行試驗(yàn)研究。菌株的初步種屬鑒定表明，M3-4與深藍(lán)鏈霉菌具有最大序列相似性，達(dá)到100%，在基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一支，親緣關(guān)系最近。該菌株基內(nèi)菌絲彎曲呈樹根狀、不斷裂；氣生菌絲多分枝；孢子絲較長且直、呈柔曲形；孢子呈橢圓形，表面光滑與陜西鏈霉菌（Streptomyces shaanxiensis）相一致，無顯著性差異。

植物根際土壤微生物在改善土壤肥力、 改善根際環(huán)境、 促進(jìn)根系生長和防治植物病害等方面均有一定的作用［30-32］。Grudev［33］和Karavaiko［34］等發(fā)現(xiàn)解鉀菌可以破壞不溶性鉀礦物的結(jié)構(gòu)，從鉀礦物中釋放出SiO2和K+，其對(duì)礦物結(jié)構(gòu)的破壞作用與胞外多糖及低分子量的酸性代謝產(chǎn)物有關(guān)。不同菌株的解鉀特性和解鉀能力各異，李海龍等［35］從土壤中分離的一株解鉀菌對(duì)鉀長石的解鉀率為25.1%；趙飛等［36］從鉀礦物表面分離的兩株解鉀菌對(duì)鉀長石的解鉀率為29.8%和25.4%；賀積強(qiáng)等［37］從紫色土中篩選獲得的40株解鉀菌的解鉀率為0.66%-7.90%。培養(yǎng)條件對(duì)微生物的解鉀能力也有較大的影響，培養(yǎng)條件通過影響微生物的生長和代謝產(chǎn)物進(jìn)而影響解鉀能力，菌株在不同培養(yǎng)條件下，解鉀能力差異性波動(dòng)十分顯著。本研究結(jié)果表明，解鉀菌M3-4以培養(yǎng)時(shí)間為120 h，pH為6時(shí)解鉀能力最大，解鉀率高達(dá)29.73%和29.99%；培養(yǎng)120 h以后，其解鉀能力稍有降低，但基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，而pH在5-7，溫度在28℃-32℃區(qū)間內(nèi)，解鉀率均高于27%。在選擇鉀長石粉量和溶解氧方面，從實(shí)際應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)效益綜合考慮，鉀長石粉量為7.5 g，搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min時(shí)，解鉀能力基本達(dá)最佳狀態(tài)，解鉀率分別為29.44%和29.95%，與后續(xù)的處理無顯著差異，解鉀率均在29%以上。本試驗(yàn)中，菌株M3-4以麥芽糖為碳源解鉀能力最高，以葡萄糖為碳源解鉀能力最低，解鉀率分別為30.08%和19.15%，前者為二糖，后者為單糖，解鉀率相差10%，差異性顯著。而該菌株氮源的利用條件，以有機(jī)氮為氮源時(shí)顯著高于以無機(jī)氮為氮源時(shí)的解鉀能力。

4 結(jié)論

解鉀菌解鉀能力的強(qiáng)弱是作為評(píng)價(jià)其性能的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)從香蕉根際土壤中分離、篩選出16株高效解鉀菌，通過鑒定和解鉀率的測定，最終獲得一株解鉀能力較強(qiáng)的鏈霉菌M3-4。解鉀菌株M3-4對(duì)鉀長石的平均解鉀率為29.91%，培養(yǎng)液中有效鉀含量為350 mg/L，具有較大的解鉀優(yōu)勢，對(duì)開發(fā)微生物菌肥和鉀肥的使用具有指導(dǎo)意義，是綠色農(nóng)業(yè)興起和發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening，Identification and Potassium-dissolving Characteristics of Potassium-dissolving Actinomycete in Banana Rhizosphere Soil

Chen Yufeng1，2Ke Chunliang2Zhou Dengbo2Gao Zhufen2Qi Chunlin1Zhang Xiyan2
（1. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，China Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101）

According to the characteristics and mechanism of potassium-dissolving by potassium-dissolving bacteria， strains of the highly efficient and stable potassium-dissolving bacteria were isolated from the banana rhizosphere soil. Firstly by primary screening in potassiumdissolving separation culture medium and screening culture medium， a number of highly efficient potassium-dissolving bacteria were obtained. Then identifying the strain types and determining the potassium-dissolving ratio in laboratory， highly efficient strains of potassium-dissolving actinomycetes were gained. Finally， based on the morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis， the strains were identified， the potassium-dissolving ratios of them were measured under different conditions， and the potassiumdissolving characteristics were studied. After identifying the isolated 16 strains of efficient potassium-dissolving bacteria and measuring their potassium-dissolving ratios， finally a stable potassium-dissolving Streptomycete M3-4 was obtained. The potassium-dissolving ratio reached the highest under the conditions： 120 h， 30℃， pH=6， the medium potassium mineral content was 5 g， shaking speed in 250 r/min， maltose as carbon source， and peptone as nitrogen sources. The strain is Streptomyces shaanxiensis and potassium-dissolving ratio is about 20%.

banana rhizosphere soil；actinomycete；potassium-dissolving ratio

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.020

2014-11-02

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-32）

陳宇豐，男，碩士研究生，研究方向：熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)；E-mail：cyfhndx@126.com

戚春林，男，副教授，研究方向：熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)；E-mail：chunlinqu@163.com