陳哲 黃靜 趙佳 王長(zhǎng)彪 梁宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

解淀粉芽孢桿菌抑菌機(jī)制的研究進(jìn)展

陳哲 黃靜 趙佳 王長(zhǎng)彪 梁宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生種類繁多的抑菌物質(zhì)，可以有效的抑制真菌和細(xì)菌的活性。近幾年來(lái)，關(guān)于解淀粉芽孢桿菌抑菌機(jī)制的研究報(bào)道越來(lái)越多，大部分研究已經(jīng)深入到分子水平。綜述了國(guó)內(nèi)外有關(guān)解淀粉芽孢桿菌的全基因組信息和解淀粉芽孢桿菌抑菌機(jī)制的相關(guān)研究。

解淀粉芽孢桿菌；基因組；抑菌機(jī)制

目前，在生物防治菌中人們研究較多的是芽孢桿菌。芽孢桿菌是土壤和自然界的優(yōu)勢(shì)微生物種群，廣泛存在于自然界中，大多為非致病性細(xì)菌，對(duì)人畜無(wú)害，并且很多種類都具有抑制植物病害生長(zhǎng)的能力。芽胞桿菌大多為內(nèi)生芽胞，繁殖速度快，抗逆能力強(qiáng)，易定殖在植物根際表面。芽孢細(xì)菌種類繁多，廣泛應(yīng)用于生物防治的種類有枯草芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌及解淀粉芽孢桿菌［1］。目前關(guān)于生防菌的基礎(chǔ)研究集中在抑菌物質(zhì)的種類、產(chǎn)生條件和分離純化等方面，隨著部分菌株全基因組測(cè)序的完成，研究已經(jīng)逐步深入到分子水平，研究者開始關(guān)注抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)基因簇以及研究單個(gè)基因或者某幾個(gè)關(guān)聯(lián)基因?qū)τ谝志镔|(zhì)分泌的影響等。已經(jīng)有研究成功的通過Genome shuffling得到能大量分泌抑菌物質(zhì)的突變菌株，改造后的突變菌株F2-38，surfactin的搖瓶產(chǎn)量比對(duì)照提高了3.5倍，在發(fā)酵罐中產(chǎn)量提高了10.3倍，而熒光定量（fluorescent quantitation，F(xiàn)Q）RT-PCR分析證實(shí)，菌株F2-38的surfactin合成酶基因srfA的表達(dá)量時(shí)原始菌株的15.7倍［2］。本文主要對(duì)國(guó)內(nèi)外解淀粉芽孢桿菌的抑菌基因和抑菌機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，對(duì)于今后工作的開展有重要意義。

1 解淀粉芽孢桿菌的全基因序列

1.1 解淀粉芽孢桿菌的基因組信息預(yù)測(cè)

從2007年解淀粉芽孢桿菌FZB42基因組序列的公布開始，已經(jīng)有大約20多株不同的解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序。

作為首個(gè)被測(cè)序的菌株，對(duì)解淀粉芽孢桿菌FZB42基因組序列的研究最為深入，其主要特征在表1中列出，同時(shí)還與枯草芽孢桿菌基因組進(jìn)行了比較。解淀粉芽孢桿菌FZB42可以編碼3 693個(gè)基因，與芽孢桿菌屬的其他成員相比，其中有310個(gè)基因是其特有的［3，4］。

2013年，解淀粉芽孢桿菌UCMB5036完成測(cè)序，其基因組大小是3 910 324 bp，G+C的比例為46.60%，預(yù)測(cè)有3 660個(gè)編碼序列（CDSs），89個(gè)tRNA基因序列，10個(gè) rRNA操作子，預(yù)測(cè)包含3 842個(gè)預(yù)測(cè)的開放閱讀框（ORF），其中95.39%的序列與菌株FZB42基因組序列具有同源性，這表明這兩個(gè)菌株之間有高度的基因同線性（gene synteny）［5］。

表1 解淀粉芽孢桿菌FZB42基因組與枯草芽孢桿菌的主要特征比較

1.2 抑菌物質(zhì)的相關(guān)基因簇

根據(jù)解淀粉芽孢桿菌FZB42的全基因組序列信息，我們發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生種類繁多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以抑制植物根際中的有害細(xì)菌和真菌。在解淀粉芽孢桿菌的基因序列中有9個(gè)巨大基因簇可以指導(dǎo)合成生物活性肽和聚酮化合物，二者分別在非核糖體肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）的組織下合成（表2）。非核糖體肽合酶（NRPS）是由許多功能模塊組成的復(fù)雜酶合成體系［6］，模塊的數(shù)量、種類和排列順序決定了最終產(chǎn)物具有多樣性的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制。聚酮化合物的生物合成途徑遵循和脂肽合成途徑一樣的規(guī)則［7］。

表2 參與非核糖體合成途徑的基因簇

在解淀粉芽孢桿菌FZB42中，能夠合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因總長(zhǎng)為340 kb，約占總遺傳力的8.5%，是枯草芽孢桿菌的兩倍［8］。而且在枯草芽孢桿菌中沒有發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)合成脂肽bacillomycin D，聚酮化合物difficidin 和macrolactin以及一種未知肽鏈的相關(guān)基因簇［7］。

同樣的，解淀粉芽孢桿菌UCMB5036的基因組序列中也包含了非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）和聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）基因簇：surfactin、fengycin、difficidin、bacilysin、macrolactin、bacillaene、bacillomycin D 和bacillibactin，這些基因簇負(fù)責(zé)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，菌株UCMB5036基因組中還包含其他功能的基因：分解代謝的植物來(lái)源的化合物、耐重金屬和藥物、運(yùn)動(dòng)和趨化、根定植，以及其他可以使細(xì)菌具有植物共生優(yōu)勢(shì)的功能［5］。

1.3 核糖體合成途經(jīng)的相關(guān)基因

與脂肽和聚酮化合物相比，蛋白質(zhì)類及酶類的抑菌物質(zhì)合成所涉及的基因就相對(duì)簡(jiǎn)單許多，并且合成過程也很明確，遵循一般蛋白質(zhì)的核糖體合成過程。值得注意的是，在枯草芽孢桿菌中羊毛硫抗生素lantibiotics（mersacidin和 subtilin）是常見的由核糖體合成的細(xì)菌素，但是解淀粉芽孢桿菌FZB42卻不能合成這種物質(zhì)，基因組中沒有相應(yīng)的編碼基因，但是卻有阻礙其合成的基因簇［4］。

2 抑菌機(jī)制的研究

目前，關(guān)于抑菌物質(zhì)的抑菌機(jī)理有一定的研究，但還是沒有形成完整的體系。一般來(lái)說，抑菌物質(zhì)可能在會(huì)在3個(gè)方面起作用：對(duì)病原菌的生長(zhǎng)起到抑制作用；誘導(dǎo)植株的體內(nèi)基因和免疫系統(tǒng)發(fā)生變化；抑菌物質(zhì)使得拮抗菌具有一定特性，通過菌體的運(yùn)動(dòng)定殖在植株根部，發(fā)揮抑制作用。

2.1 對(duì)病原菌的作用

抑菌物質(zhì)對(duì)病原菌的抑制主要體現(xiàn)在對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的抑制，以及對(duì)孢子萌發(fā)的影響這兩方面。

解淀粉芽孢桿菌YN- 1能夠抑制棉花枯萎病菌，用菌株發(fā)酵液的粗提物處理病原菌，結(jié)果表明，YN -1菌株粗提液能夠造成該病原菌的菌絲消融、變細(xì)，菌絲膜發(fā)生破裂，原生質(zhì)體凝集滲漏，菌絲體扭曲變形，形成泡囊結(jié)構(gòu)，孢子的產(chǎn)生受到嚴(yán)重抑制［9］。

利用高效液相色譜HPLC分析發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌SWB16能夠分泌脂肽類抑菌物質(zhì)芬枯草菌素和伊枯草菌素。試驗(yàn)證明，這兩種物質(zhì)可以抑制球孢白僵菌生長(zhǎng)：一方面對(duì)孢子發(fā)芽及生長(zhǎng)具有明顯的抑制及破壞作用，絕大多數(shù)分生孢子裂解，出現(xiàn)內(nèi)容物外溢現(xiàn)象；另一方面，菌絲前部生長(zhǎng)端出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，菌絲體出現(xiàn)多處出現(xiàn)瘤狀畸形，菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制［10］。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用純脂肽芬枯草菌素fengycins處理串珠鐮刀菌后，菌絲體內(nèi)出現(xiàn)較大的囊泡，部分菌絲頂端破裂，菌絲膜也會(huì)受到破壞。但是，fengycins不容易破壞串珠鐮刀菌孢子的膜透性。此外，還發(fā)現(xiàn)卵磷脂很可能是fengycins在膜上的作用靶標(biāo)，并且，fengycins能夠抑制串珠鐮刀菌分泌的磷脂酶A2的活性，該性質(zhì)很可能也在fengycins的抑菌活性中起到了一定作用［11］。

2.2 對(duì)植株的作用

當(dāng)菌株在植物根際定殖或大量繁殖時(shí)，抑菌物質(zhì)可能會(huì)促使植物體內(nèi)發(fā)生改變。例如，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)中的酶發(fā)生變化，或者系統(tǒng)抗病性發(fā)生變化。

有研究者對(duì)拮抗細(xì)菌 C-02 防治棉花黃萎病的機(jī)理展開了研究。結(jié)果表明，菌株C-02處理棉苗后，棉葉中植株防御性酶系中的苯丙氨酸解氨酶PAL、過氧化物酶POD 和多酚氧化酶PPO的活性提高幅度大，維持時(shí)間長(zhǎng)，提高了棉苗系統(tǒng)防御能力，降低了病原菌侵染的可能性［12］。

誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性（ISR）是由寄生在植物根部的有益菌，或者稱為植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的、對(duì)逆境和病害的系統(tǒng)抗性。研究表明，當(dāng)受到溫度或者水分脅迫時(shí)，植物的誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗病性（ISR）水平會(huì)下降；如果事先用解淀粉芽孢菌株S499對(duì)植株進(jìn)行處理，就能夠降低這種負(fù)面影響。分析證實(shí)，在低溫情況下，解淀粉芽孢桿菌S499菌株的surfactin產(chǎn)量會(huì)顯著提高，增加菌株在植株根部的定殖能力，從而使得植物誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗病性ISR的水平能維持平衡。許多試驗(yàn)表明，surfactin與菌株在植物根際的活動(dòng)，包括定殖能力、叢集運(yùn)動(dòng)以及生物膜的形成有關(guān)得以實(shí)現(xiàn)［13］。

2.3 抑菌物質(zhì)自身的抑制作用

解淀粉芽孢桿菌分泌的抑菌物質(zhì)有很多種，常見的種類分為脂肽類物質(zhì)、聚酮類物質(zhì)還有具有蛋白活性的抑菌物質(zhì)。它們可以通過影響菌體自身的叢集運(yùn)動(dòng)、定殖能力、生物膜形成能力，促使菌體在植物根際大量繁殖或者定殖，進(jìn)而起到保護(hù)作用。目前研究較多的是脂肽類的抑菌物質(zhì)，解淀粉芽孢桿菌SQR9可以合成bacillomycin D和fengycin兩種脂肽，對(duì)香蕉枯萎病菌有顯著的拮抗作用。根據(jù)菌株SQR9分合的兩種物質(zhì)，研究構(gòu)建了兩種突變體：bacillomycin D 合成能力受到阻礙的突變體SQR9M1，對(duì)尖孢鐮刀菌有輕微的抑制作用；fengycin合成能力受到阻礙的突變體SQR9M2，其抑菌能力等同于野生型菌株SQR9。此外，通過在根部的原位實(shí)驗(yàn)以及定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，bacillomycin D有助于生物膜的形成［14］。

解淀粉芽孢桿菌FZB42的自發(fā)GFP熒光的突變體FB01mut可以用來(lái)研究菌株在不同物種中的定殖情況。在玉米中，突變體FB01mut主要定殖在初生根外表細(xì)胞的表面以及初生根和側(cè)根的交界處；而突變體FB01mut在擬南芥定植定植時(shí)，優(yōu)先定殖于根尖；對(duì)于浮萍，突變體FB01mut通過形成生物膜定殖在葉子和根部，從定殖菌的浮萍植株上只提取到了表面活性素surfactin［15］。

還有研究者采用綠色熒光蛋白標(biāo)記解淀粉芽孢桿菌FZB42發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌定植在不同物種的植物的根的表面表現(xiàn)不同。為了闡明哪些基因是根定植的關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一系列突變體，即abrB-、sigH-、sigD-、nrfA-、yusV、RBAM017410、sfp、pabB-、pznA-和degU。用共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行掃描分析發(fā)現(xiàn)，野生型菌株大量定殖在根尖和側(cè)根的表面，而突變體定殖在根尖的能力受到了影響，并且大多數(shù)突變體不能在側(cè)根定殖。其中，sfp、pabB-、pznA-和 degU基因被敲除的突變體菌株影響了細(xì)菌形成生物膜的能力以及菌體的群集運(yùn)動(dòng)，從而影響其在根部定殖的能力，這與大多數(shù)研究結(jié)果一致。有趣的是，菌株在植物根部的定殖能力依賴于生物膜的形成能力及群集運(yùn)動(dòng)。例如，試驗(yàn)中構(gòu)建的6個(gè)突變體，abrB-、sigH-、sigD-、 nrfA-、yusV和RBAM017410，它們?cè)诟康亩ㄖ衬芰︼@著下降，但是卻沒有影響菌株生物膜的形成，而且突變株nrfA-和yusV雖然不能在根尖或者或側(cè)根定殖，但是卻可以定殖在細(xì)胞邊緣及根的表面［16］。

為了研究菌株和根系表面接觸的分子機(jī)制，采用cDNA為基礎(chǔ)的消減抑制雜交，在解淀粉芽孢桿菌B55中鑒定出了7個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)DNA片段。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，在解淀粉芽孢桿菌B55和水稻根部共培養(yǎng)1 h之后，ansB（天門冬氨酸氨-裂合酶）和odhA（2-酮戊二酸脫氫酶E1組分）基因的RNA表達(dá)上調(diào)；隨著菌株和植物互相作用的時(shí)間增長(zhǎng)，odhA基因呈連續(xù)上調(diào)表達(dá)，而ansB則在2 h后發(fā)生下調(diào)表達(dá)，這表明與水稻根部接觸的早期，ansB的上調(diào)表達(dá)是瞬間?？梢钥闯?，在細(xì)菌與植物根際相互作用的初期，會(huì)受到植物根系分泌物和根際微生物表面接觸的影響，這一時(shí)期是根際細(xì)菌定殖根部的關(guān)鍵時(shí)期，同時(shí)也開始促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［17］。

需要注意的是，盡管我們能夠?qū)⒁种茩C(jī)理大致分為以上3種情況，但是在大自然中，抑菌物質(zhì)在病原菌、植株和菌體三者之間發(fā)揮抑制作用一定依賴一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)是我們今后研究的主要任務(wù)，尤其是在分子水平上的抑菌原理還需要進(jìn)行更透徹的研究，包括基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究等，逐漸構(gòu)建出完整系統(tǒng)的抑菌調(diào)控體系，為抑菌物質(zhì)更好的發(fā)揮作用奠定良好的分子基礎(chǔ)。

3 展望

到目前為止，解淀粉芽孢桿菌的抑菌作用研究已經(jīng)廣泛開展，但是生物體是復(fù)雜多變的，仍然有很多東西是未知的，并且利用解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行生物防治的前景十分廣闊，所以要加強(qiáng)對(duì)抑菌物質(zhì)的分子研究。未來(lái)，抑菌物質(zhì)的分子研究應(yīng)該集中在以下幾個(gè)方面：研究抑菌調(diào)控體系，明確抑菌物質(zhì)在病原菌、植株和菌體三者之間發(fā)揮作用的機(jī)制；改良合成抑菌物質(zhì)的相關(guān)基因，使菌株產(chǎn)生更多的抑菌物質(zhì)，從而有更強(qiáng)的抑菌能力；找到抑制病原菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因，將其轉(zhuǎn)入到植物中，使得植物本身具有抵抗病原菌的能力；使用高表達(dá)的宿主菌進(jìn)行抗菌物質(zhì)的高效表達(dá)，開展抑菌物質(zhì)生物制劑的研究，包括制劑的規(guī)?；a(chǎn)、儲(chǔ)存條件、存活期限、施用方法以及施入土壤后的存活條件和繁衍系數(shù)等方面；還可以通改造已知抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，人工合成抗菌物質(zhì)，從而在植物真菌的生物防治中發(fā)揮不亞于天然抑菌物質(zhì)的作用［18］。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances on Antibacterial Mechanism of Bacillus amyloliquefaciens

Chen Zhe Huang Jing Zhao Jia Wang Changbiao Liang Hong
（Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agriculture Science，Taiyuan 030031）

Bacillus amyloliquefaciens produces a wide range of antibacterial substances which effectively inhibit fungal and bacterial activities. In recent years， more and more studies have focused on antibacterial mechanism of B. amyloliquefaciens， and most of them already at the molecular level. Hence， we review the research progress on the genome sequences and antibacterial mechanism of B. amyloliquefaciens in this study.

Bacillus amyloliquefaciens；genome；antibacterial mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.004

2014-09-16

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院產(chǎn)品項(xiàng)目（2012ycp18），山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2009021032-1），山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013GG22）

陳哲，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向：拮抗菌抑菌物質(zhì)；E-mail：changer0006@163.com

梁宏，助理研究員，研究方向：微生物；E-mail：lh1964@126.com