牛旭龍 馮萬(wàn)軍 馬金虎 邢國(guó)芳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

植物長(zhǎng)鏈非編碼RNA功能研究進(jìn)展

牛旭龍 馮萬(wàn)軍 馬金虎 邢國(guó)芳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是新近發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子，其廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，并可對(duì)環(huán)境脅迫作出響應(yīng)。就lncRNA的產(chǎn)生與分類方法、植物中已報(bào)道的lncRNA及其對(duì)植物不同器官發(fā)育過(guò)程的影響、lncRNA與小RNA的關(guān)系、有關(guān)lncRNA的研究方法及目前研究中面臨的問(wèn)題進(jìn)行了介紹。

植物lncRNA；生物學(xué)功能；研究方法；miRNA

經(jīng)典的中心法則中認(rèn)為基因一般的表達(dá)過(guò)程為經(jīng)DNA轉(zhuǎn)錄生成RNA，再翻譯為蛋白質(zhì)，最終實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。其中，RNA分子被認(rèn)為是在這一過(guò)程中攜帶信息的唯一信使。但是，自克里克提出該理論以來(lái)，中心法則已經(jīng)過(guò)了極大發(fā)展，RNA分子的角色也有了很大變化，研究證實(shí)在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中它不僅是一個(gè)中間媒介，而且也是具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的分子。海量的基因組序列數(shù)據(jù)證實(shí)：DNA上編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域（也就是通常說(shuō)的基因）只占人類和其他高等動(dòng)植物基因組的極小部分，在人體中僅有不到3%的序列編碼蛋白質(zhì)，基因組的絕大部分都不編碼蛋白質(zhì)和多肽［1］。此外，即使在具有較小基因組的模式植物擬南芥中，具有編碼蛋白質(zhì)功能的基因組序列也僅占整個(gè)基因組的50%以下［2］。在過(guò)去幾十年的現(xiàn)代生物學(xué)研究中，人們的思路維持在一個(gè)“基因-mRNA-蛋白質(zhì)-功能”的定式，從而有意無(wú)意地忽視了對(duì)基因組中非編碼RNA的研究。

實(shí)際上，真核生物中存在多種非編碼RNA，如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNAs）、核糖體RNA（rRNAs）、小核RNA（snRNAs）、 小RNA（siRNAs和microRNAs）及長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）［3］。其中，lncRNA的長(zhǎng)度一般在200-100 000 nt之間，占所有非編碼RNA的80%以上［4］。目前，有關(guān)小RNA的研究報(bào)道較多，部分小RNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控功能已基本清楚，然而有關(guān)lncRNA功能的研究仍較少。另外在技術(shù)上，由于lncRNA的構(gòu)成單元是核苷酸，某些RNA的改變，不足以改變它的主要功能，因此使得lncRNA很難被傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法所發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，更多新的lncRNA的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控功能的研究已經(jīng)成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。因此，本文將對(duì)這一領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展作一綜述，旨在為后人的研究提供思路與方法。

1 lncRNA的產(chǎn)生及分類

類似于其他大多數(shù)RNA，lncRNA 也由RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄而來(lái)。然而，最新發(fā)現(xiàn)了一些lncRNA卻由RNA 聚合酶 III轉(zhuǎn)錄，這與tRNA 和 5S RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程相似［5］，另外還有一些lncRNA是經(jīng)RNA 聚合酶V轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生［6］。大量的動(dòng)物基因組測(cè)序結(jié)果顯示，lncRNA具有典型的RNA特征，如5'端帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴等。大多數(shù)lncRNA分布在細(xì)胞核內(nèi)，也有少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)組分里［7］。

lncRNA具有類型多、作用模式多和數(shù)量多的“三多”特點(diǎn)。因此，有關(guān)lncRNA的分類方法也有多種。根據(jù)其在基因組轉(zhuǎn)錄的位置lncRNA可分為3類：天然反義轉(zhuǎn)錄（NATs）、基因間lncRNA（lincRNA）和內(nèi)含子lncRNA［8］（圖1）。天然反義轉(zhuǎn)錄（NATs）是一組編碼蛋白質(zhì)或非編碼蛋白質(zhì)的RNAs與其他（有義）轉(zhuǎn)錄物具有互補(bǔ)序列可以調(diào)節(jié)有義鏈的表達(dá)［9］。NATs最早在病毒和原核生物中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)來(lái)源NATs可以分為兩類：順式NATs（cis-NATs）和反式NATs（trans-NATs）［10，11］。cis-NATs由基因組相同位點(diǎn)的反義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，互補(bǔ)區(qū)在兩個(gè)基因的重疊部分，重疊長(zhǎng)且完全互補(bǔ)，通常以“一對(duì)一”的方式調(diào)節(jié)有義鏈的表達(dá)［12］。而 trans-NATs則是在不同位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正義和反義轉(zhuǎn)錄本，可與多個(gè)轉(zhuǎn)錄本部分互補(bǔ)，如部分trans-NATs后期加工可形成 microRNA或siRNA［13］?，F(xiàn)在已有多種方法用于NATs的鑒定，如基因表達(dá)的連續(xù)分析、cDNA序列分析、Northern雜交、鏈特異性RT-PCR及電子雜交和基因芯片等，并對(duì)多種生物的NATs進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。NATs在基因組中普遍存在，在植物中占7%-9%，動(dòng)物中除了線蟲較少，在其他動(dòng)物中可達(dá)到5%-30%［14］。基因間lncRNA（lincRNA）廣泛參與哺乳動(dòng)物細(xì)胞免疫監(jiān)視、周期調(diào)控、胚胎干細(xì)胞多能性分化等多種生物學(xué)過(guò)程［15］。利用染色質(zhì)分離技術(shù)（chromatin isolation by RNA purification，CHIRP）在全基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)眾多的lincRNA結(jié)合于特定的序列上，并且證實(shí)lincRNA在不同物種間具有高度的保守性，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)［16］。內(nèi)含子lncRNA與表觀遺傳有密切聯(lián)系，一個(gè)典型的內(nèi)含子lncRNA- ANRASSF1通過(guò)招募PRC2到RASSF1A啟動(dòng)子上，降低RASSF1A的表達(dá)并增加細(xì)胞增殖，為描述其他內(nèi)含子lncRNAs作用的位置特異性與表觀遺傳調(diào)節(jié)提供了依據(jù)［17］。

圖1 LncRNA三種類型

如根據(jù)其功能差異將其分成兩類：一類影響細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程，這類lncRNA通過(guò)反式作用、形成干擾RNA或直接與基因組DNA或蛋白互作調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白/轉(zhuǎn)錄水平；第二類是通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄、剪切或相鄰基因的表達(dá)起作用［18］。而參照其與蛋白質(zhì)編碼基因的位置關(guān)系，可將它們分為正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內(nèi)lncRNA和基因間lncRNA等5類［19］。

2 不同植物中篩選到的lncRNA

動(dòng)物中的lncRNA研究主要集中在人、大鼠和線蟲上，利用lncRNA沉默與定位分析（combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs，c-KLAN）、RNA免疫沉淀法（RNA-immunoprecipatation，RIP）、CHART（capture hybridization of RNA target）和ChRIP（chromatin RNA immunoprecipatation）等可對(duì)lncRNA進(jìn)行功能缺失和細(xì)胞定位，通過(guò)研究lncRNA與蛋白質(zhì)、DNA和RNA相互作用，探討其功能與作用機(jī)制。

與動(dòng)物相比，對(duì)于植物中l(wèi)ncRNA的研究才剛剛開(kāi)始?，F(xiàn)在仍主要依賴全基因組 cDNA文庫(kù)、微陣列和RNA測(cè)序等高通量的技術(shù)對(duì)lncRNA進(jìn)行全基因組范圍的篩選。迄今為止，僅在少數(shù)幾種植物中鑒定出lncRNA，涉及擬南芥、玉米、水稻和大豆等［20，21］。目前在植物中篩選到超過(guò)9 000個(gè)lncRNAs，占總lncRNA的1%，其中部分lncRNA的生物學(xué)功能已經(jīng)相對(duì)清楚，如Liu等［22］采用tilling array技術(shù)，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了6 480個(gè)基因間轉(zhuǎn)錄本，其中2 708個(gè)lncRNAs可通過(guò)實(shí)驗(yàn)被檢測(cè)到，一些lncRNA基因表現(xiàn)出較強(qiáng)的器官表達(dá)特異性，而其他的則與生物/非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。與此同時(shí)，Zhang等［23］利用40個(gè)RNA-Seq數(shù)據(jù)集對(duì)水稻全基因組進(jìn)行分析后，最終篩選到2 063個(gè)lncRNAs，其中大部分在水稻生殖過(guò)程中表現(xiàn)出特異性，進(jìn)一步的功能分析顯示，一些lncRNA可造成生殖缺陷。除擬南芥和水稻外，Zhang還對(duì)玉米自交系B73和Mo17進(jìn)行正反交實(shí)驗(yàn)，分析了胚乳中所有等位基因表達(dá)情況，最終找到38個(gè)在胚乳中表達(dá)的lncRNA與基因印記有關(guān)。其中，有25個(gè)來(lái)源于母本，而其余13個(gè)來(lái)自父本。另外，Boerner等［24］鑒別出了玉米全長(zhǎng)cDNA序列中包含的潛在lncRNA，結(jié)果顯示，玉米基因組的基因和基因間位點(diǎn)序列中廣泛存在非編碼RNA的模板區(qū)域，同時(shí)推測(cè)它們可能通過(guò)多種RNA介導(dǎo)機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。綜上所述，植物中存在有大量lncRNA，這可能與植物在生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中存在復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。

3 植物中l(wèi)ncRNA的功能

3.1 lncRNA影響植物生長(zhǎng)發(fā)育

在植物中，lncRNA廣泛存在并參與生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的調(diào)節(jié)。研究表明，lncRNA 對(duì)植物發(fā)育的影響已滲透到根系、花器官建成及花粉發(fā)育等各個(gè)方面。研究表明很多l(xiāng)ncRNA在生物體發(fā)育的特定階段產(chǎn)生，具有組織或細(xì)胞特異性［25］，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳等方面調(diào)控基因的表達(dá)。

春化作用是環(huán)境控制的表觀遺傳學(xué)開(kāi)關(guān)，研究證實(shí)，冬季的低溫可以沉默開(kāi)花阻遏基因FLC（FLOWERING LOCUS C）進(jìn)而使植物在春季開(kāi)花。原因在于長(zhǎng)時(shí)間低溫處理可誘導(dǎo)春化不敏感基因（VIN3）的表達(dá)，進(jìn)而形成PRC2復(fù)合物，使開(kāi)花阻遏基因H3K27me3處組蛋白大量被修飾，從而降低FLC基因表達(dá)水平。Swiezewski等［26］分析了擬南芥單核苷酸序列多態(tài)性，最終在基因組FLC基因所在的兩條鏈50 kb的相鄰區(qū)域找到兩個(gè)lncRNA并分別將其命名為COLDAIR和COOLAIR。這兩個(gè)lncRNA均可與PRC2蛋白復(fù)合體結(jié)合，從而造成FLC染色質(zhì)組蛋白甲基化， 最終促進(jìn)植物開(kāi)花。這種低溫春化過(guò)程發(fā)生在植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段， 而開(kāi)花結(jié)實(shí)過(guò)程在其后， 因此春化效應(yīng)通過(guò)細(xì)胞有絲分裂傳遞， 并不傳遞給子代。

Ding等［27］發(fā)現(xiàn)水稻光敏不育系（PGMS）受一個(gè)長(zhǎng)為1 236個(gè)堿基的lncRNA調(diào)節(jié)，并稱之為L(zhǎng)DMAR（long-day-specific male-fertility-associated RNA ），長(zhǎng)日照條件下，足夠的LDMAR 轉(zhuǎn)錄量是維持正?；ǚ郯l(fā)育所必需的，但由于一個(gè)單堿基突變?cè)斐蒐DMAR 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致LDMAR 在長(zhǎng)日照下轉(zhuǎn)錄量降低，造成正處于發(fā)育的花藥提前程序化死亡，出現(xiàn)不育性狀。另外有研究表明，光溫敏核不育系在P/TMS12-1位點(diǎn)編碼一個(gè)獨(dú)特的非編碼RNA，進(jìn)而加工成一個(gè)21 nt的小RNA——osa-smR5864w，從而導(dǎo)致粳稻農(nóng)墾58S（NK58S）和秈稻培矮64S雄性不育性狀的出現(xiàn)［28］。對(duì)比兩個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雄性不育系的12號(hào)染色體22258571位點(diǎn)存在C-G堿基顛換，這可能與自發(fā)突變引起的單核苷酸多態(tài)性（SNP）改變了LDMAR的二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終造成雄性不育性狀的出現(xiàn)。另外，在玉米中也發(fā)現(xiàn)了一些參與生長(zhǎng)發(fā)育的lncRNA。如Dai等和Ma等［29，30］從玉米成熟花粉cDNA文庫(kù)中克隆到Zm401，該基因在花粉發(fā)育過(guò)程中特異表達(dá)，參與花藥的發(fā)育進(jìn)程。前期我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)在玉米雜交種與親本間差異表達(dá)的lncRNA-ZmUHR，其在根尖、幼穗等部位集中表達(dá)，并且表現(xiàn)為雜種上調(diào)，在47個(gè)與ZmUHR基因序列相一致的siRNAs中，有41個(gè)在雜種中特異表達(dá)。認(rèn)為一些siRNAs在雜種中的差異表達(dá)可能是由于其前提轉(zhuǎn)錄水平的改變引起的［31］。

3.2 lncRNA在植物對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用

研究表明，許多l(xiāng)ncRNAs對(duì)不同的逆境也有響應(yīng)，包括一些生物和非生物脅迫［26，32-34］。如對(duì)擬南芥研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)2 h或10 h干旱、低溫、高鹽或脫落酸處理后，有1 832個(gè)lncRNAs表達(dá)水平發(fā)生明顯變化。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，能提高植物抗病能力的延伸因子elf18基因（EF-Tu）能夠促進(jìn)一些lincRNAs（intergenic lncRNAs）的表達(dá)［22］。與擬南芥的研究結(jié)果相似，在小麥中有125個(gè)lncRNAs對(duì)白粉病和高溫脅迫有響應(yīng)［31］。上述研究結(jié)果表明，植物lncRNA可能通過(guò)多種途徑來(lái)承受環(huán)境壓力，進(jìn)而使植物更好地應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫，這為人們進(jìn)一步了解它們的生物學(xué)功能積累了豐富的資料。

除了大規(guī)模鑒定脅迫響應(yīng)lncRNAs外，其中幾個(gè)lncRNAs的生物學(xué)功能及作用機(jī)理也相對(duì)清楚。如COLDAIR和COOLAIR這兩個(gè)與生殖發(fā)育過(guò)程有關(guān)的lncRNAs，它們響應(yīng)寒冷天氣能誘導(dǎo)擬南芥開(kāi)花［26，34］。此外，IPS1和AT4受磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)阻礙miR399對(duì)其靶基因磷酸酯酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PHO2的抑制作用實(shí)現(xiàn)功能［35］。另有一個(gè)lncRNA——Npc536在擬南芥根和葉中受磷饑餓和鹽脅迫后誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，Npc536超表達(dá)后可以促進(jìn)根系生長(zhǎng)，從而使擬南芥適應(yīng)磷饑餓和鹽脅迫環(huán)境［36］。PHO1在植物體內(nèi)起平衡體內(nèi)磷酸鹽的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在水稻基因組中含有3個(gè)PHO1的同源基因，與擬南芥中僅有的兩個(gè)參與磷從根部向地上部運(yùn)轉(zhuǎn)的基因AtPHO1和AtPHO1；H1不同，水稻的3個(gè)PHO1能產(chǎn)生天然順式反義轉(zhuǎn)錄本。在磷酸鹽缺失的情況下，水稻PHO1；2表達(dá)量增加，PHO1；2蛋白濃度也隨之增加，然而PHO1；2的mRNA豐度卻沒(méi)有變化。多聚核糖體分析顯示，PHO1；2和反義NAT有激活核糖體轉(zhuǎn)錄的功能，揭示了lncRNA如何不依賴提高mRNA 表達(dá)量影響蛋白質(zhì)水平［37］。

還需要注意的是，類病毒是一類使植物發(fā)病的lncRNAs，由一個(gè)246-400個(gè)核苷酸單鏈環(huán)狀分子組成。由于類病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后需要改變了lncRNA調(diào)控的區(qū)域化，了解類病毒條區(qū)域化的機(jī)制可能為深入了解細(xì)胞器如何運(yùn)輸外源和內(nèi)源lncRNA提供思路［38］。

3.3 植物中l(wèi)ncRNA與小RNA的關(guān)系

作為一種新型的起調(diào)控作用的RNA，lncRNA可以以長(zhǎng)鏈的形式直接在RNA水平上發(fā)揮功能，也可以形成短的microRNA（miRNA）和 small interfering RNA（siRNA）這兩種主要的小分子RNA，影響生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)［13］。長(zhǎng)久以來(lái)，對(duì)于植物中l(wèi)ncRNA的功能研究主要集中在模式植物擬南芥上。lncRNA基因TAS3的轉(zhuǎn)基因的結(jié)果表明，超表達(dá)TAS3使得擬南芥?zhèn)雀扉L(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)TAS3切割形成的miR390基因的靶基因，tasiARFs的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，而miR390突變體中ta-siARFs表達(dá)則顯著降低，表明這些lncRNAs是miRNA的前體。在人類和其他物種的基因組中一些lncRNA序列也是短非編碼RNA的前體。通過(guò)分析擬南芥全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)發(fā)現(xiàn)，76條新的lncRNAs和不同類型的小RNA前體npcRNAs，如miRNA、tasiRNA和24 nt的siRNA［32，39］。RT-PCR分析表明，npc83 是miR869a的前體，它在DCL4 突變體中積累。另外，在水稻中研究發(fā)現(xiàn)，p/tms12-1 是一個(gè)非編碼RNA基因，它的原始轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過(guò)至少兩次加工產(chǎn)生一個(gè)小RNA，與正常水稻品種相比，溫敏不育水稻在該小RNA序列內(nèi)存在一個(gè)單堿基突變，該突變影響了小RNA的表達(dá)水平，進(jìn)而可能與靶基因互作而導(dǎo)致雄性不育［28］。

最新研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥和水稻中，一些lncRNA可以作為小RNA的內(nèi)源誘捕靶標(biāo)（eTM），如 miR160、miR166、miR156、miR159和 miR172，能夠有效抑制這些小RNA的功能實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR160和miR166的內(nèi)源誘捕靶標(biāo)在調(diào)控植物發(fā)育方面發(fā)揮重要的作用。通過(guò)突變體研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的lncRNA-AT4調(diào)控植物對(duì)低磷脅迫逆境的適應(yīng)是通過(guò)長(zhǎng)鏈的形式直接與miR399結(jié)合，降低miR399的表達(dá)，而 miR399通過(guò)靶向作用調(diào)控下游基因PHO2（UBC24）的表達(dá)，從而維持植物體的磷穩(wěn)態(tài)［37］。在植物中，IPS1是一個(gè)廣泛存在的受磷饑餓誘導(dǎo)的lncRNA，在植物的根和芽中特異表達(dá)，IPS1含有與miR399互補(bǔ)配對(duì)的基序，但是這種互補(bǔ)配對(duì)被一個(gè)位于miR399的剪切位點(diǎn)的錯(cuò)配環(huán)打斷，從而阻礙miR399剪切IPS1，同時(shí)也使得miR399被螯合，并且兩者的結(jié)合比miR399與其底物的結(jié)合更有競(jìng)爭(zhēng)性。因此，當(dāng)IPS1過(guò)量表達(dá)后，大量的miR399與IPS1配對(duì)，只有少數(shù)miR399與靶基因PHO2的mRNA配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA的大量積累，最終表現(xiàn)為枝條中磷含量的降低［35］。這種miRNA抑制機(jī)制稱為靶基因模擬。靶基因模擬提供了一種新的分析miRNA功能的方法。

4 lncRNA的研究方法

近期，研究人員越來(lái)越重視lncRNA，認(rèn)為lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，廣泛參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老等生理過(guò)程［40］。lnc-RNAs調(diào)節(jié)機(jī)制多樣，包括作為小RNA為前體［41］，介導(dǎo)染色質(zhì)重塑［17］，順式激活鄰近基因［42，43］，作為多蛋白復(fù)合物的支架［44］及反式作用于靶基因座［42］。為揭示lncRNA的分子作用機(jī)制，人們借助多種分子生物學(xué)研究方法，如微陣列（microarray）、RNA-seq、Northern 印跡（Northern blot）、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRTPCR）、熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）和RNA干擾（RNA interference，RNAi）等分子生物學(xué)技術(shù)篩選到一些lncRNA［16］。然而對(duì)植物中l(wèi)ncRNA的研究仍處于初級(jí)階段，目前l(fā)ncRNA的研究主要集中在依賴生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)lncRNA，以挖掘其中l(wèi)ncRNA的序列、結(jié)構(gòu)、表達(dá)及功能等信息。使用生物信息學(xué)方法對(duì)RNA-seq測(cè)序結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行RNAi和RIP等lncRNA功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可以避免功能研究實(shí)驗(yàn)的盲目性，從而節(jié)約大量實(shí)驗(yàn)成本［45］。如Qi等［46］在模擬干旱條件下，利用RNA-seq技術(shù)并結(jié)合麥金尼斯篩選長(zhǎng)鏈非編碼RNA的方法對(duì)谷子進(jìn)行全基因組系統(tǒng)地識(shí)別，最終確定了584條lncRNAs（494 lincRNAs和 90 NATS）。其中兩個(gè)干旱調(diào)控NATs-Si003758m和Si038715m。Si003758m與植物氧化脅迫耐性相關(guān)，在PEG誘導(dǎo)的干旱條件下，Si003758m的正義和反義轉(zhuǎn)錄物均顯著增加，Si038715m編碼羥脯氨酸糖蛋白（HRGP），它是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，在植物發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用［47］，也能提高植物的抗病性［48，49］

5 結(jié)語(yǔ)

借助于深度測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和生物信息學(xué)手段，有關(guān)植物lncRNA的研究已經(jīng)取得長(zhǎng)足發(fā)展，可以預(yù)見(jiàn)，在不久的將來(lái)有關(guān)lncRNA的生物學(xué)功能鑒定的報(bào)道將出現(xiàn)井噴現(xiàn)象。但由于目前有關(guān)lncRNA的研究仍處于起步階段，因此面臨許多亟待解決的問(wèn)題：（1）lncRNA的界定仍存在爭(zhēng)議。目前仍然依賴于是否具有開(kāi)放閱讀框這一結(jié)構(gòu)特征來(lái)判斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA是編碼還是非編碼RNA，實(shí)際上研究發(fā)現(xiàn)一些lncRNA包含ORF，而該ORF編碼與某些已知基因編碼蛋白質(zhì)的同源序列。另外，從長(zhǎng)度上對(duì)lncRNA進(jìn)行劃分的方法也存在較大爭(zhēng)議，lncRNA 是一般被認(rèn)為長(zhǎng)度大于 200 nt，這一標(biāo)準(zhǔn)作為界定lncRNA過(guò)于武斷，因?yàn)樾∮?00 nt的非編碼RNA中很多既不屬于小RNA（small RNA）也不屬于結(jié)構(gòu)RNA（structural RNA），對(duì)其所屬類別仍不是很清晰。（2）對(duì)其描述也不夠全面，很難使初學(xué)者很快了解lncRNA的信息，交叉借鑒的可能性較小。lncRNA生物學(xué)功能的闡明并非易事。（3）lncRNA尚無(wú)統(tǒng)一的命名原則：一方面，如何區(qū)分功能性和非功能性非編碼轉(zhuǎn)錄物依然存在困難；另一方面，由于lncRNA種類和功能的多樣性，致使不同的lncRNA研究結(jié)果之間借鑒意義并不大。（4）對(duì)lncRNA的鑒定存在困難，在技術(shù)上，由于lncRNA的構(gòu)成單元是核苷酸，某些RNA的改變，不足以改變它的主要功能，因此使得lncRNA很難被傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)。（5）用于 lncRNA 研究的技術(shù)多是一些高通量的方法，如何避免轉(zhuǎn)錄干擾是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，而且大量的lncRNA信息獲得后人們不能有效的進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析。主要是因?yàn)橄嚓P(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)依然很少，有關(guān)算法也因?qū)ncRNA信息的認(rèn)識(shí)不夠而在算法上有所匱乏。因此，需要建立更多更有效的方法用于系統(tǒng)地研究lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能。

綜合來(lái)看，目前人們對(duì)lncRNA的了解只是冰山一角。人產(chǎn)對(duì)于植物中l(wèi)ncRNA的認(rèn)識(shí)過(guò)程，目前已從lncRNA的篩選過(guò)渡到對(duì)其基因功能的注釋和作用機(jī)制的研究，鑒于有關(guān)動(dòng)物lncRNA的信息更加豐富，值得我們借鑒。此外，針對(duì)lncRNA 的結(jié)構(gòu)特征和作用機(jī)制的數(shù)據(jù)信息，建立新的研究技術(shù)體系將是未來(lái)一個(gè)重要的研究方向。

［1］ 陳潤(rùn)生. 非編碼 RNA［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics， 2013， 40（7）：591-592.

［2］Matsui A， Ishida J， Morosawa T， et al. Arabidopsis transcriptome analysis under drought， cold， high-salinity and ABA treatment conditions using a tiling array［J］. Plant and Cell Physiology，2008， 49（8）：1135-1149.

［3］Bai Y， Dai X， Harrison AP， Chen M. RNA regulatory networks in animals and plants：a long noncoding RNA perspective［J］. Briefings in Functional Genomics， 2015， 14（2）：91-101.

［4］Esteller M. Non-coding RNAs in human disease［J］. Nature Reviews Genetics， 2011， 12（12）：861-874.

［5］ Dieci G， Fiorino G， Castelnuovo M， et al. The expanding RNA polymerase III transcriptome［J］. Trends Genet， 2007， 23：614-622.

［6］Wu J， Okada T， Fukushima T， et al. A novel hypoxic stressresponsive long non-coding RNA transcribed by RNA polymerase III in Arabidopsis［J］. RNA Biol， 2012， 9：302-313.

［7］Managadze D， Rogozin IB， Chernikova D， et al. Negative correlation between expression level and evolutionary rate of long intergenic noncoding RNAs［J］. Genome Biol Evol， 2011， 3：1390-1404.

［8］ Moran VA， Perera RJ， Khalil AM. Emerging functional and mechanistic paradigms of mammalian long non-coding RNAs［J］. Nucleic Acids Research， 2012， 40（14）：6391-6400.

［9］謝兆輝. 天然反義轉(zhuǎn)錄物及其調(diào)控基因的表達(dá)機(jī)制［J］. 遺傳，2010， 32（2）：122-128.

［10］ Chen D， Yuan C， Zhang J， et al. PlantNATsDB：a comprehensive database of plant natural antisense transcripts［J］. Nucleic Acids Research， 2012， 40（D1）：D1187-D1193.

［11］ Yin Y， Zhao Y， Wang J， et al. antiCODE：a natural sense-antisense transcripts database［J］. BMC Bioinformatics， 2007， 8：319.

［12］ Prasanth KV， Spector DL. Eukaryotic regulatory RNAs：an answer to the ‘genome complexity’conundrum［J］. Genes & Development， 2007， 21（1）：11-42.

［13］ Lindsey S， Raghavendra C， Sivalingam KM. Data gathering algorithms in sensor networks using energy metrics［J］. IEEE Transactions on Parallel and Distributed Systems， 2002， 13（9）：924-935.

［14］ Lapidot M， Pilpel Y. Genome-wide natural antisense transcription：coupling its regulation to its different regulatory mechanisms［J］. EMBO Reports， 2006， 7（12）：1216-1222.

［15］ 李靈， 宋旭. 長(zhǎng)鏈非編碼RNA在生物體中的調(diào)控作用［J］.遺傳， 2014， 36（3）：228-236.

［16］夏天， 肖丙秀， 郭俊明. 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 的作用機(jī)制及其研究方法［J］. 遺傳， 2013， 35（3）：269-280.

［17］ De Lucia F， Dean C. Long non-coding RNAs and chromatin regulation［J］. Curr Opin Plant Biol， 2011， 14（2）：168-173.

［18］Tripathi V， Ellis JD， Shen Z， et al. The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation［J］. Molecular Cell， 2010， 39（6）：925-938.

［19］Ponting CP， Oliver PL， Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］. Cell， 2009， 136（4）：629-641.

［20］Ponjavic J， Ponting CP， Lunter G. Functionality or transcriptional noise？ Evidence for selection within long noncoding RNAs［J］. Genome Research， 2007， 17（5）：556-565.

［21］ Struhl K. Transcriptional noise and the fidelity of initiation by RNA polymerase II［J］. Nat Struct Mol Biol， 2007， 14（2）：103-105.

［22］ Liu J， Jung C， Xu J， et al. Genome-wide analysis uncovers regulation of long intergenic noncoding RNAs in Arabidopsis［J］. The Plant Cell Online， 2012， 24（11）：4333-4345.

［23］Zhang M， Zhao H， Xie S， et al. Extensive， clustered parental imprinting of protein-coding and noncoding RNAs in developing maize endosperm［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2011， 108（50）：20042-20047.

［24］Boerner S， McGinnis KM. Computational identification and functional predictions of long noncoding RNA in Zea mays［J］. PloS One， 2012， 7（8）：e43047.

［25］Lindberg D， de la Fuente Revenga M， Widersten M. Temperature and pH dependence of enzyme-catalyzed hydrolysis of transmethylstyrene oxide. A unifying kinetic model for observed hysteresis， cooperativity， and regioselectivity［J］. Biochemistry，2010， 49（10）：2297-2304.

［26］ Swiezewski S， Liu F， Magusin A， et al. Cold-induced silencing by long antisense transcripts of an Arabidopsis Polycomb target［J］. Nature， 2009， 462（7274）：799-802.

［27］ Ding J， Lu Q， Ouyang Y， et al. A long noncoding RNA regulatesphotoperiod-sensitive male sterility， an essential component of hybrid rice［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（7）：2654-2659.

［28］ Zhou H， Liu Q， Li J， et al. Photoperiod-and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA［J］. Cell Research，2012， 22（4）：649-660.

［29］ Dai XY， Yu JJ， Zhao Q， et al. Non-coding RNA for ZM401， a pollen-specific gene of Zea mays［J］. Acta Botanica Sinica-English Edition， 2004， 46（4）：497-504.

［30］ Ma J， Yan B， Qu Y， et al. Zm401， a short open reading-frame mRNA or noncoding RNA， is essential for tapetum and microspore development and can regulate the floret formation in maize［J］. Journal of Cellular Biochemistry， 2008， 105（1）：136-146.

［31］ Xin M， Wang Y， Yao Y， et al. Identification and characterization of wheat long non-protein coding RNAs responsive to powdery mildew infection and heat stress by using microarray analysis and SBS sequencing［J］. BMC Plant Biology， 2011， 11（1）：61.

［32］ Amor BB， Wirth S， Merchan F， et al. Novel long non-protein coding RNAs involved in Arabidopsis differentiation and stress responses［J］. Genome Research， 2009， 19（1）：57-69.

［33］ Mercer TR， Dinger ME， Mattick JS. Long non-coding RNAs：insights into functions［J］. Nat Rev Genet， 2009， 10：155-159.

［34］ Heo JB， Sung S. Vernalization-mediated epigenetic silencing by a long intronic noncoding RNA［J］. Science， 2011， 331（6013）：76-79.

［35］ Franco-Zorrilla JM， Valli A， Todesco M， et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity［J］. Nature Genetics， 2007， 39（8）：1033-1037.

［36］ Wierzbicki AT， Haag JR， Pikaard CS. Noncoding transcription by RNA polymerase Pol IVb/Pol V mediates transcriptional silencing of overlapping and adjacent genes［J］. Cell， 2008， 135（4）：635-648.

［37］ Jabnoune M， Secco D， Lecampion C， et al. A rice cis-natural antisense RNA acts as a translational enhancer for its cognate mRNA and contributes to phosphate homeostasis and plant fitness［J］. The Plant Cell Online， 2013， 25（10）：4166-4182.

［38］ Gómez G， Pallás V. Viroids：a light in the darkness of the lncRNA-directed regulatory networks in plants［J］. New Phytologist， 2013， 198（1）：10-15.

［39］ Hirsch J， Lefort V， Vankersschaver M， et al. Characterization of 43 non-protein-coding mRNA genes in Arabidopsis， including the MIR162a-derived transcript［sJ］. Plant Physiology， 2006， 140（4）：1192-1204.

［40］ 祁云霞， 劉永斌， 榮威恒. 轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù)：RNA-Seq 及其應(yīng)用［J］. 遺傳， 2011， 33（11）：1191-1202.

［41］ Kim TK， Hemberg M， Gray JM， et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers［J］. Nature， 2010， 465（7295）：182-187.

［42］ Kim ED， Sung S. Long noncoding RNA：unveiling hidden layer of gene regulatory networks［J］. Trends in Plant Science， 2012， 17（1）：16-21.

［43］ ?rom UA， Derrien T， Beringer M， et al. Long noncoding RNAs with enhancer-like function in human cells［J］. Cell， 2010， 143（1）：46-58.

［44］ Tsai MC， Manor O， Wan Y， et al. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes［J］. Science， 2010，329（5992）：689-693.

［45］ 白晶， 李力恒， 孫堯， 等. 傳統(tǒng)中草藥高通量測(cè)序技術(shù) RNA-seq 及 lncRNA 挖掘的應(yīng)用策略［J］. 中醫(yī)藥信息， 2014（2）：20-23.

［46］ Qi X，Xie S，Liu Y， et al. Genome-wide annotation of genes and noncoding RNAs of foxtail millet in response tosimulated drought stress by deep sequencing［J］. Plant Mol Biol，2013，83（4-5）：459-473.

［47］ Hall Q， Cannon MC. The cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein RSH is essential for normal embryo development in Arabidopsis［J］. Plant Cell， 2002， 14（5）：1161-1172.

［48］ Deepak S， Shailasree S， Kini RK， et al. Role of hydroxyproline-rich glycoproteins in resistance of pearl millet against downy mildew pathogen Sclerospora graminicola［J］. Planta， 2007， 226（2）：323， 333.

［49］ Carrieri C， Cimatti L， Biagioli M， et al. Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat［J］. Nature， 2012， 491（7424）：454-457.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Biological Functions of Long Non-coding RNA in Plants

Niu Xulong Feng Wanjun Ma Jinhu Xing Guofang
（College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

Long non-coding RNAs（lncRNAs）as newly discovered regulators for gene expression， participate in a wide range of biological processes in plants， and also could response to environmental stresses. In this review， we summarize the generation and classification of lncRNAs， the discovered lncRNAs in plants， their effects on the development processes of different organs in plants， as well as the relationship between lncRNA and small RNA， research methods， and issues in the current studies of lncRNAs.

plant lncRNA；biological function；research methods；miRNA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.001

2014-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200914），山西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2012021023-4），中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2012M520600），山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2015145）

牛旭龍，男，碩士，研究方向：玉米功能基因組學(xué)；E-mail：ycyznxl@163.com

邢國(guó)芳，女，博士，副教授，研究方向：功能基因組及抗逆脅迫；E-mail：xingguofang9596@sina.com