劉焱，劉倫倫，羅燦，瞿朝霞

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128）

不同方法提取的草魚魚皮膠原蛋白性質(zhì)比較

劉焱1，2，劉倫倫1，羅燦1，瞿朝霞1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128）

采用酸法、堿法、酶法、水法從魚皮中提取膠原蛋白，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，提取率，酸法＞酶法＞堿法＞水法；熱變性溫度，水法＞酶法＞堿法＞酸法；水法和堿法提取的膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜條帶中出現(xiàn)β二聚體和γ三聚體，酶法和酸法沒有出現(xiàn)，但是酶法和酸法的α鏈位置明顯色帶濃于水法和堿法；紫外吸收光譜中，酸法和堿法的吸收峰強(qiáng)度大于水法和酶法，堿法和酶法左側(cè)出現(xiàn)了雜峰；紅外光譜顯示，堿法提取的魚皮膠原蛋白不具備酰胺帶特征吸收峰，其二級(jí)結(jié)構(gòu)已破壞，酸法、酶法和水法提取的膠原蛋白均存在酰胺帶特征吸收峰，而且出現(xiàn)位置相似，符合膠原蛋白特征吸收峰。

魚皮膠原蛋白；酸法；提取率；電泳

膠原蛋白由糖、甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等組成，以不溶性纖維形式存在多細(xì)胞動(dòng)物體的皮膚、骨骼、血管中[1]，它具有生物相容性、生物降解性、低抗原性，其提取制品已廣泛應(yīng)用與醫(yī)藥、保健、食品加工、化妝品等眾多領(lǐng)域[2]。長(zhǎng)期以來，膠原蛋白主要從一些陸生哺乳動(dòng)物如牛、豬等的皮膚中提取[3]，近年來，人們逐漸將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)移到魚類膠原蛋白的研究上來[4]。魚類膠原蛋白以Ⅰ型膠原為主，無支鏈，有四級(jí)結(jié)構(gòu)[5]，具有一定的凝膠性、高度的分散性、低黏度性、吸水性、持水性以及乳化性等特點(diǎn)[6]，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，可以作為一種安全的美容和醫(yī)用生物材料[7]，魚膠原蛋白材料的開發(fā)利用日益成為研究的熱點(diǎn)[8]。魚皮是水產(chǎn)品副產(chǎn)物中膠原蛋白含量比較多的部位，草魚是我國(guó)的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚[9]，草魚魚皮中，蛋白質(zhì)含量達(dá)到25.4%[10]。目前關(guān)于魚類膠原蛋白的研究大都是以測(cè)定提取液中羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù)[11-12]，并未對(duì)多種方法提取所得的膠原蛋白物質(zhì)的特性進(jìn)行具體系統(tǒng)的分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)新合作超市；冰乙酸、氯化鈉、氧化鈣、冰醋酸、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氯胺T、高氯酸、異丙醇、甲醇、堿性蛋白酶（酶活力≧200 U/mg）、三羥基甲基氨基甲烷（生物試劑）等：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（優(yōu)級(jí)純）：上海金穗生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

681型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；THZ-92氣浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：金壇市成輝儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）減壓抽濾裝置：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD-1D-50 WFJ7200分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司；UV-2450紫外吸收光譜儀：島津（香港）有限公司；DYCZ-24DN電泳儀：北京市六一儀器廠；Nicolet6700傅里葉紅外光譜儀：賽默飛世爾科技（原熱電公司）分子光譜部。

1.3 膠原蛋白的提取及純化方法

1.3.1 魚皮的預(yù)處理

先將魚皮用濃度為10%的異丙醇處理以除去脂肪，然后用0.1 mol/L氫氧化鈉處理以除去其中的雜蛋白及色素，將處理后的魚皮漂洗干凈，備用。

1.3.2 魚皮膠原蛋白的酸法提取及純化

預(yù)處理后魚皮→加入0.5 mol/L檸檬酸溶液，檸檬酸溶液∶魚皮為10∶1（mL/g）室溫下振蕩提取24 h→紗布過濾（濾渣續(xù)提24h）→提取液（4000r/min離心20min）→上清液→加5 mol/L氯化鈉（使?jié)舛葹?.9 mol/L）→靜置分層（12 h）→離心（5 000 r/min，20 min）→回收絮狀物→加0.5 mol/L醋酸使其溶解→取清液→加5mol/L氯化鈉（使?jié)舛葹?.9 mol/L）→回收上浮絮狀物→透析（蒸餾水中透2 d，每8 h換一次液）→冷凍干燥

1.3.3 魚皮膠原蛋白的堿法提取

預(yù)處理后魚皮→加入3%Ca（OH）2溶液，Ca（OH）2溶液∶魚皮為20∶1（mL/g）室溫下振蕩提取24 h→紗布過濾（濾渣續(xù)提24h）→提取液（4000r/min離心，20min）→上清液→加6 mol/LHCl（使pH為3）→靜置分層（12 h）→離心（5 000 r/min，20 min）→回收沉淀→透析（蒸餾水中透2 d，每8 h換一次液）→冷凍干燥

1.3.4 魚皮膠原蛋白的水法提取

預(yù)處理后魚皮→加入蒸餾水，蒸餾水∶魚皮為20∶1（mL/g）70℃下震蕩提取48 h→紗布過濾（濾渣續(xù)提48 h）→提取液（4 000 r/min離心20 min）→上清液→加5 mol/L NaCl（使?jié)舛葹?.9 mol/L）→靜置分層（12 h）→離心（5 000 r/min，20 min）→回收上浮絮狀物→透析（蒸餾水中透2 d，每8 h換一次液）→冷凍干燥

1.3.5 魚皮膠原蛋白的酶法提取

預(yù)處理后魚皮→加入0.5 mol/L乙酸溶液，乙酸溶液∶魚皮為20∶1（mL/g）50℃振蕩提取8 h→紗布過濾（濾渣續(xù)提8 h）→提取液（4 000r/min離心20 min）→上清液→加5 mol/L NaCl（使?jié)舛葹?.9 mol/L）→靜置分層（12h）→離心（5000r/min，20 min）→回收上浮絮狀物→透析（蒸餾水中透2 d，每8 h換一次液）→冷凍干燥

1.4 魚皮膠原蛋白提取率測(cè)定方法

1.4.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[13]

以L-羥脯氨酸的吸光度值為縱坐標(biāo)，L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程：y=0.026 8x-0.001 1，其中R2=0.999 2，y為560 nm處測(cè)定的吸光度值，x為羥脯氨酸含量。

圖1 羥脯氨酸含量與吸光度值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The content of hydroxyproline and the absorbance of standard curve

1.4.2 魚皮膠原蛋白的提取率測(cè)定[14]

精確稱取樣品3 mg～5 mg，操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，得出吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得各樣品中羥脯氨酸的含量。用測(cè)定的羥脯氨酸含量乘以相應(yīng)的系數(shù)（11.1）得出樣品中膠原蛋白的含量（g/g樣品），原料中膠原蛋白理論含量為原料的質(zhì)量（濕重）乘以相應(yīng)的系數(shù)（13.13%），提取率為樣品中提取的膠原蛋白含量與原料中膠原蛋白理論含量的比值，按測(cè)定羥脯氨酸的數(shù)值和膠原蛋白的提取率繪制柱形圖。

樣品中膠原蛋白提取量的計(jì)算公式：

式中：M為樣品中膠原蛋白的提取量，g；x為某個(gè)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對(duì)應(yīng)的羥脯氨酸含量，（ug/mL）；v1為吸收提取液的體積，mL。v2為稀釋后的體積，mL；11.1為羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數(shù)。

膠原蛋白提取率/%=（樣品中膠原蛋白提取量/原料中膠原蛋白理論含量）×100%

1.5 魚皮膠原蛋白的特性分析方法

1.5.1 魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜掃描

將凍干的膠原蛋白粉溶于0.5 mol/L的乙酸，配成1 g/L膠原溶液。用UV-2550紫外分光光度計(jì)，在190 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，高速掃描最大吸收波長(zhǎng)，得紫外光最大吸收波圖。

1.5.2 魚皮膠原蛋白的SDS-PAGE電泳

分離膠和濃縮膠以SDS-PAGE不連續(xù)體系凝膠配制[15]，其中分離膠：12%的丙烯酰胺；濃縮膠：5%的丙烯酰胺。染色液：0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250-甲醇溶液，以45%的甲醇作為母液來配制0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250；脫色液（醋甲醇液）：5%醋酸-7.5%甲醇液，以7.5%的甲醇作為母液來配制5%醋酸。配制好后制膠，然后加電極緩沖液，對(duì)樣品進(jìn)行處理后上樣、電泳。

1.5.3 魚皮膠原蛋白的熱變性溫度測(cè)定

準(zhǔn)確稱取75mg膠原蛋白凍干品于25mL0.1mol/L乙酸中，用超聲波促進(jìn)完全溶解，設(shè)置快速粘度計(jì)程序?yàn)?℃/min，初始溫度為室溫23℃，終止溫度60℃，測(cè)定粘度，按增比粘度值與溫度關(guān)系作折線關(guān)系圖。

1.5.4 魚皮膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）掃描

取凍干的膠原蛋白2 mg與KBr壓片，置于紅外光譜儀的變溫附件中。掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1分辨率為4 cm-1。采用儀器的變溫附件和控溫裝置，掃描溫度點(diǎn)為20、35、60、90、110℃，每個(gè)溫度點(diǎn)保溫20 min，對(duì)前3個(gè)溫度點(diǎn)掃描信號(hào)累加200次，得紅外光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法的魚皮膠原蛋白提取率比較

不同方法提取魚皮膠原蛋白前的脫脂和雜蛋白的前處理都一致，且每個(gè)提取方法所采用的工藝是現(xiàn)有研究報(bào)道中總結(jié)所得的最佳提取的工藝，圖2對(duì)四種不同方法提取魚皮膠原蛋白的提取率進(jìn)行了對(duì)比。

圖2 不同方法提取魚皮膠原蛋白的提取率比較Fig.2 Comparison of extraction rate of collagen extracted of skin in different methods

從圖2可以看出，酸法和酶法提取的效果明顯優(yōu)于堿法和水法，水法的得率最低，酸法得率最高，酶法中所用木瓜蛋白酶作用化學(xué)鍵較廣泛，所以膠原蛋白提取率較低。堿法在蛋白質(zhì)鹽析過程中絮狀物多，且透析后絮狀物有明顯減少，這說明可能有低分子水溶性物質(zhì)從透析袋中流失，這與堿法提取膠原時(shí)鍵破壞情況有一定的關(guān)聯(lián)，堿法提取的膠原還存在消旋轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)。水法提取率低則可能源于水分子與氫鍵作用力不大。

2.2 不同方法提取的魚皮膠原蛋白感官性狀比較

不同方法提取的膠原蛋白均為冷凍干燥后的感官性狀，酸法和酶法提取產(chǎn)物多，結(jié)構(gòu)蓬松，呈棉絮狀，表面平整，水法提取物呈棉花絲狀，堿法提取物呈黃褐偏黑色，粘著在平皿上。具體結(jié)果見表1。

表1 不同方法提取的魚皮膠原蛋白感官比較Table 1 Comparison of characteristics of collagen extracted of fish skin in different methods

2.3 不同方法提取的魚皮膠原蛋白性質(zhì)比較

2.3.1 魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜分析

據(jù)紫外光譜圖分析，在紫外光譜220 nm～250 nm區(qū)內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，說明該溶液中存在有共軛不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。在紫外光譜區(qū)250 nm～290 nm內(nèi)有強(qiáng)吸收峰的物質(zhì)，說明該溶液中有含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。而就蛋白質(zhì)水解溶液而言，脯氨酸、羥脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸5種氨基酸都具有共軛雙鍵的結(jié)構(gòu)，而后三者都是含苯環(huán)的芳香族氨基酸，他們的紫外最大吸收峰分別苯丙氨酸257 nm、酪氨酸275 nm、色氨酸280 nm，其中以色氨酸紫外吸收最為強(qiáng)烈，常利用色氨酸在280 nm處有一個(gè)紫外強(qiáng)吸收峰對(duì)未知蛋白溶液進(jìn)行定量分析[16]。膠原蛋白因?yàn)椴缓彼岬确枷阕灏被幔栽?80 nm左右都沒有強(qiáng)吸收峰，這是輔助鑒別膠原蛋白的一種方法。圖3為酸法、酶法、水法、堿法提取的膠原蛋白紫外吸收光譜圖。

圖3 不同方法提取的魚皮膠原蛋白紫外吸收光譜Fig.3 UV spectra of collagen extracted of skin in different method

從圖中可以看出，4種不同方法提取的魚皮膠原蛋白溶液在220 nm～230 nm處均有一個(gè)尖銳的吸收峰，與Ⅰ型膠原蛋白紫外特征吸收峰出現(xiàn)的位置（225 nm處左右）基本一致。4種方法提取的魚皮膠原蛋白溶液在250 nm～290 nm處不存在特征吸收峰，說明提取物中沒有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等這些氨基酸。從圖中發(fā)現(xiàn)在膠原蛋白溶液220 nm左側(cè)還有些許小吸收峰，特別是堿法和水法所提取的魚皮膠原蛋白溶液，這可能是由于水法和堿法的提取中產(chǎn)生了一些含-COOH或-COOR結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，而酸法和酶法提取的魚皮膠原蛋白溶液中可能含有的物質(zhì)這類不多，所以只是最大吸收峰稍微左移一點(diǎn)沒有形成獨(dú)立的特征峰。

2.3.2 不同方法提取的魚皮膠原蛋白SDS—PAGE電泳分析

膠原蛋白是（αl）（αl）（α2）、（αl）（α2）（α3）組成的三螺旋結(jié)構(gòu)[17]。從哺乳動(dòng)物提取的膠原蛋白三條α肽鏈可能兩條相同，而從魚類中提取的膠原蛋白三條肽鏈可能全不同，其中γ三聚體為三條α肽鏈組成的膠原分子，β二聚體為兩條α肽鏈的組成的膠原分子，電泳圖譜中條帶的光密度反映提取物的大致濃度，條帶出現(xiàn)位置反映分子量的大小[18]。圖4為4種方法提取的魚皮膠原蛋白SDS—PAGE電泳圖譜。

從圖4中電泳圖譜結(jié)果可以看出，酸法、酶法條帶寬明顯粗于水法、堿法，從條帶的光密度來看，酸法和酶法條帶在α鏈處有，水法和堿法幾乎都沒有，看到的α鏈較為模糊，但γ三聚體和β二聚體有痕跡。根據(jù)在電泳中的遷移位置，水法和酶法有兩條不同的α鏈，含量和位置也幾乎相同，只是堿法和水法的γ三聚體的位置出現(xiàn)了痕跡，這可能與乙酸破壞了γ三聚體和β二聚體的交聯(lián)有關(guān)，條帶其它部分基本與酸法的相同。

圖4 不同方法提取的魚皮膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of skin collagen extracted of skin in different methods

2.3.3 不同方法提取的魚皮膠原蛋白的熱變性溫度比較

熱變性溫度是膠原蛋白三螺旋被破壞時(shí)的溫度，它主要由羥脯氨酸含量決定，一般認(rèn)為水產(chǎn)膠原蛋白熱變性溫度低于哺乳動(dòng)物膠原蛋白。有研究指出，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與羥脯氨酸的含量呈正相關(guān)關(guān)系，含量越高，熱穩(wěn)定性溫度就越高，膠原蛋白穩(wěn)定性也就越強(qiáng)[19]。羥脯氨酸決定熱穩(wěn)定性的本質(zhì)是羥脯氨酸吡咯環(huán)對(duì)膠原的二級(jí)結(jié)構(gòu)的固定化的貢獻(xiàn)和羥脯氨酸的中氫鍵的作用力。

膠原蛋白熱穩(wěn)定性可以由膠原溶液的熱變性溫度表達(dá)，通過熱變性曲線來反映。膠原蛋白的變性溫度可以通過增比粘度與溫度的關(guān)系來確定。從膠原蛋白熱變性溫度曲線上，增比粘度變?yōu)樵瓉淼?0%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度即為熱變性溫度[20]。圖5為4種方法提取的魚皮膠原蛋白增比粘度與溫度曲線。

圖5 魚皮膠原蛋白增比粘度與溫度曲線圖Fig.5 Change curve of viscosity of collagen extracted of skin with temperature rising

從圖5可以看出，四法提取的魚皮膠原蛋白的熱變性溫度在33℃～36℃之間，水法＞酶法＞堿法＞酸法，其中堿法和酸法提取的膠原蛋白增比粘度差距不大，其熱變性溫度也很相近；水法和酶法所提取的膠原蛋白雖然增比粘度比堿法和酸法提取的膠原蛋白小很多，但其熱變性溫度均大于堿法和酸法提取的膠原蛋白。

2.3.4 不同方法提取的魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析比較

分別對(duì)酶法、堿法、酸法、水法4種方法提取所得草魚魚皮膠原蛋白進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，結(jié)果見圖6～圖9。

圖6 酶法提取的魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectrum of PSC from grass carp skin

圖7 堿法提取的魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.7 Fourier transform infrared spectrum of ASF from grass carp skin

圖8 酸法提取的魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.8 Fourier transform infrared spectrum of ASC from grass carp skin

圖9 水法提取的魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.9 Fourier transform infrared spectrum of WSF from grass carp skin

根據(jù)4種不同方法提取的草魚魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜圖，表2給出了酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ和羥脯氨酸的吸收峰和峰強(qiáng)度變化。

表2 不同方法提取的草魚皮膠原紅外光譜特征吸收峰的位置及說明Table 2 Fourier transform infrared spectroscopy spectra peak locations and assignment of grass carp skin collagen cm-1

從表2可以看出：①酰胺A帶。酸法、酶法、堿法和水法從魚皮中提取的膠原蛋白在由N-H伸縮振動(dòng)引起的酰胺A帶處特性吸收峰分別出現(xiàn)在3 321.14 cm-1、3 310.15cm-1、3 346.62cm-1、3 322.1 cm-1處，都出現(xiàn)向低波數(shù)位移的現(xiàn)象，表明4種方法提取的魚皮膠原蛋白的N-H伸縮都與氫鍵形成了締合體。②酰胺B帶。四種方法提取的魚皮膠原蛋白均在3 084 cm-1具有吸收峰，即由C-N伸縮引起的特征吸收峰。③酰胺Ⅰ帶。由C=O伸縮振動(dòng)引起的特征吸收峰，一般在1 600 cm-1～1 700 cm-1處，是二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域。除堿法外，酸法、水法以及酶法均在此處具有特征吸收峰，其中酸法和酶法特征吸收峰在酰胺Ⅰ帶對(duì)應(yīng)的α螺旋結(jié)構(gòu)1 651 cm-1附近，水法在酰胺Ⅰ帶對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)角1 662 cm-1附近，表明堿法提取的魚皮膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)受到破壞，酸法和酶法的魚皮膠原蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)保存完整，水法提取破壞了維系蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，α螺旋結(jié)構(gòu)已向轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。④酰胺Ⅱ帶。主要由C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)引起的特征吸收峰，一般在1 480 cm-1～1 600 cm-1處。除堿法外，其他3種方法都在此處具有吸收峰，并且均保存了酰胺Ⅱ帶的α螺旋結(jié)構(gòu)（1 552 cm-1處的吸收峰）。⑤酰胺Ⅲ帶。作為膠原蛋白特有的紅外特征吸收峰，一般在1 200 cm-1～1 400 cm-1處，主要由C-N伸縮振動(dòng)和N-H彎曲振動(dòng)引起的特征吸收峰。酸法和酶法在1203 cm-1、1 238 cm-1以及1 281 cm-1附近出現(xiàn)不連續(xù)特征吸收峰，表明這兩種方法提取的膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在此處沒有明顯改變，而水法則在1 338 cm-1處出現(xiàn)了Pro側(cè)鏈-CH2的搖擺振動(dòng)吸收峰，表明水法雖然出現(xiàn)α螺旋結(jié)構(gòu)向轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，但是基本的二級(jí)結(jié)構(gòu)還存在。

綜上所述，堿法提取的魚皮膠原蛋白在酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶以及酰胺Ⅲ帶均不具備相應(yīng)的特征吸收峰，表明堿法的膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)已破壞，且被分解成比較小的多肽鏈；酸法和酶法提取的膠原蛋白都具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，且酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶區(qū)的α螺旋結(jié)構(gòu)均保存比較的完好；水法提取的魚皮膠原蛋白雖然在酰胺Ⅰ帶區(qū)域其α螺旋結(jié)構(gòu)變成了轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，但其基本的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有被破壞，符合Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征吸收峰。

3 結(jié)論

酸法、堿法、酶法、水法4種方法從草魚魚皮中提取膠原蛋白，提取率方面，酸法＞酶法＞堿法＞水法；在所提取的草魚魚皮膠原蛋白熱穩(wěn)定性方面，堿法＞酸法＞水法＞酶法；對(duì)4種方法提取的膠原蛋白SDSPAGE電泳圖譜比較發(fā)現(xiàn)，水法和堿法提取的魚皮膠原蛋白的條帶中出現(xiàn)β二聚體和γ三聚體的條帶位置，酶法和酸法提取的膠原蛋白沒有出現(xiàn)，但是酶法和酸法提取的膠原蛋白的α鏈色帶明顯濃于水法的和堿法的；在紫外吸收光譜方面，酸法和堿法提取的魚皮膠原蛋白的吸收峰強(qiáng)度大于水法和酶法，且堿法和酶法左側(cè)出現(xiàn)了雜峰；紅外光譜顯示，堿法提取的魚皮膠原蛋白不具備酰胺帶特征吸收峰，其二級(jí)結(jié)構(gòu)已破壞，酸法、酶法和水法提取的膠原蛋白均存在酰胺帶特征吸收峰，而且出現(xiàn)位置相似，符合Ⅰ型膠原蛋白特征吸收峰。

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Property Comparison of Grass Carp Skin Collagen Extracted by Different Method

LIU Yan1，2，LIU Lun-lun1，LUO Can1，QU Zhao-xia1
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，Hunan，China）

Extract collagen of grass carp's skin with acid，alkali，enzyme and water method，the result of collagen's extraction yield in different method was as follow：acid＞alkali＞enzyme＞water.The result of collagen's in different method was as follow：alkali＞acid＞water＞enzyme.The result of collagen's SDS-PAGE electrophoresis was：the ribbons from water and alkali appeared in β-dipolymer and γ-tripolymer ribbons position，the ribbons from enzyme and acid no appearance，but α-chain's ribbons from enzyme and acid marks significantly thicker than ribbons from water and alkali.The result of collagen's UV scanning spectrum was：UV absorption intensity from acid and alkali were greater than that from water and enzyme，the maximum UV absorption left side from alkali and enzyme appeared some miscellaneous peaks.The result of collagen's FI-IR spectrum was：according with the characteristic absorption peak.The collagen extracted in four methods all have characteristic absorption peaks which are amideⅠ，amideⅡ，amideⅢ，and their position are similar to each other，It was in accordance withⅠcollagen's characteristic absorption peak.

fish skin collagen；acid method；extraction rate；electrophoresis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.010

國(guó)家星火計(jì)劃重大項(xiàng)目（2011GA770007）；湖南省重大科技專項(xiàng)（2010FJ1007-2）

劉焱（1970—），女（漢），副教授，博士，主要從事動(dòng)物食品加工及貯藏研究。

2013-11-15