孫天琪　曹　崢　張志華　張　妍哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江哈爾濱150081

雙酚A對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

孫天琪曹崢張志華張妍
哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江哈爾濱150081

目的研究雙酚A（BPA）對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響。方法采用固體培養(yǎng)方式評(píng)價(jià)0（對(duì)照組）、1、10、100、1000μmol/L BPA對(duì)線蟲壽命的影響（每組各70條）。結(jié)果1、10、1000μmol/L BPA對(duì)線蟲壽命無(wú)明顯影響，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，100μmol/L BPA可延長(zhǎng)線蟲的壽命（P＜0.05），最長(zhǎng)生存時(shí)間由15 d延長(zhǎng)至17 d，中位生存時(shí)間由12 d延長(zhǎng)至13 d。結(jié)論1、10、1000μmol/L濃度下BPA不會(huì)縮短線蟲壽命，100μmol/L BPA可以延長(zhǎng)線蟲壽命。

雙酚A；環(huán)境雌激素；秀麗隱桿線蟲；壽命

雙酚A（bisphenol A，BPA），化學(xué)名稱為2，2-（4，4-二羥基二苯基）丙烷，用于生產(chǎn)碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯樹脂以及殺真菌劑、抗氧化劑、染料等，并不斷開發(fā)新的用途。隨著塑料制品的廣泛應(yīng)用，BPA造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［1］。已有報(bào)道證實(shí)其可導(dǎo)致各種生物生殖功能下降，生殖器腫瘤，免疫力降低，并引起各種生殖異常和內(nèi)分泌功能紊亂［2-3］，但是沒有確切的文獻(xiàn)報(bào)道BPA對(duì)生物體的壽命是否會(huì)有影響。

化合物對(duì)壽命作用的研究，一直是科研領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問題。目前，化合物對(duì)機(jī)體靶位點(diǎn)的作研究已經(jīng)具有一定的廣度和深度，但是對(duì)于整體壽命用的研究還處于相對(duì)單一的層面，因此，利用模式生物研究藥物對(duì)壽命的作用，具有一定的理論和實(shí)際意義。本研究利用經(jīng)典的壽命研究模式生物——秀麗隱桿線蟲［4］，在固體培養(yǎng)模式下評(píng)價(jià)BPA對(duì)壽命的作用，并采取多種實(shí)驗(yàn)方式，從多方面整體考察BPA是否影響壽命，從而為評(píng)估BPA對(duì)包括人類在內(nèi)的高等哺乳動(dòng)物的壽命影響奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

野生型（N2）秀麗隱桿線蟲，由軍事科學(xué)院提供。

1.2儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（SP-02，黃山市恒豐醫(yī)療器械有限公司）、體式光學(xué)顯微鏡（SMZ-1500Nikon公司）、生物安全柜（WV-425-600E，NUAIR公司）、高速離心機(jī)（Eppendoff公司）、磁力攪拌器（D-79219，Kika-Werke公司）、去離子水機(jī)（Tankpe060，Millipore公司）。

1.3藥品與主要試劑

BPA（239658-50G）Sigma公司、氯化鈉（20121202，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司）、蛋白胨（2012329，碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司）、瓊脂糖（K1001-500g，Am resco公司）、硫酸鎂（20121225，天津市巴斯夫化工有限公司）、氯化鈣（120831，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司）、鏈霉素（0382-5g，Amresco公司）、制霉素（N3503-5MU，Sigma公司）、次氯酸鈉（120613，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司）、氫氧化鈉（130103，天津市大陸化學(xué)試劑廠）、胰蛋白胨（LP0042，OXOID公司）、酵母提取液（LP0021，OXOID公司）、二甲基亞砜（DMSO）（20140422，天津市永大化學(xué)試劑有限公司），磷酸氫二鈉（2012708，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），磷酸二氫鉀（120510，西隴化工股份有限公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1主要溶液的配制

1.4.1.1 BPA的配制配制BPA溶液母液濃度分別為：1、10、100、1000μmol/L。溶劑為100%DMSO溶液，保存至4℃冰箱。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將BPA母液1∶1000加入到OP50菌液中，使終濃度為1、10、100、1000μmol/L。對(duì)照組母液為不含BPA的溶劑即100%DMSO溶液，實(shí)驗(yàn)時(shí)將對(duì)照組母液1∶1000加入到OP50菌液中。

1.4.1.2 M9緩沖液的配制磷酸氫二鈉60 g、磷酸二氫鉀30 g、氯化鈉50 g、去離子水1 L，將以上溶液高壓滅菌后，待溫度降至60℃以下后加入1 mol/L硫酸鎂1 mL。

1.4.1.3 NGM培養(yǎng)基的配制氯化鈉3 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂糖15 g、膽固醇（溶于無(wú)水乙醇，5 mg/mL）1 mL、去離子水1 L，將以上溶液高壓滅菌后，待溫度降至60℃后加入以下試劑：1 mol/L磷酸緩沖液25 mL，1mol/L硫酸鎂1mL，1mol/L氯化鈣1mL，200mg/mL鏈霉素1mL，10mg/mL制霉素1mL。

1.4.1.4大腸埃希菌OP50溶液配制LB溶液50 mL、鏈霉素（200mg/mL）50μL、OP50原液50μL，將以上溶液靜置于37℃生化培養(yǎng)箱中孵育至吸光度值：OD600≈1.2。LB溶液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，去離子水1 L。

1.4.2秀麗隱桿線蟲同步化

選取有大量妊娠期秀麗隱桿線蟲的NGM培養(yǎng)基，用M9緩沖液將秀麗隱桿線蟲收集到15mL離心管中，并定容到3.5 mL。加入現(xiàn)配的1.5 m L消化液，混合均勻。劇烈搖晃50次，靜置2 min，重復(fù)該步驟4～5次，至秀麗隱桿線蟲蟲體消失為止。將該混合液分裝到3個(gè)1.5 mL EP管中，室溫離心（1300 r/min，離心半徑8 cm）1.5min。棄上清，加入1mLM9緩沖液，重懸，室溫離心（1300 r/min，離心半徑8 cm）1.5min。重復(fù)上一步驟兩次，加入1mLM9緩沖液，重懸后將液體移入直徑為2 cm大小有OP50菌的NGM培養(yǎng)皿中，完成同步化。20℃培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同步化消化液：次氯酸鈉2 mL，氫氧化鈉1mL。

1.4.3秀麗隱桿線蟲的固體培養(yǎng)與壽命統(tǒng)計(jì)

將同步化后48 h的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到含有0（對(duì)照組）、1、10、100、1000μmol/L BPA（1、10、100μmol/L BPA組）的NGM培養(yǎng)基中，每組重復(fù)2個(gè)平皿，每個(gè)平皿35只線蟲。在秀麗隱桿線蟲的生殖期，每天將秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，直至排卵完成后，隔天將秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中，至秀麗隱桿線蟲全部死亡為止。若用鉑絲針輕輕碰觸線蟲無(wú)反應(yīng)，則認(rèn)定線蟲死亡、由于陰門破裂死亡和從培養(yǎng)皿中逃逸的線蟲記為失蹤。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism 5軟件中的Log-rank（Mantel-Cox）Test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用GraphPad Prism 5軟件對(duì)結(jié)果作圖。

2　結(jié)果

將同步化后48 h的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到含有0、1、10、100、1000μmol/L BPA的NGM培養(yǎng)基中，觀察并記錄線蟲壽命。結(jié)果表明：各組線蟲壽命存比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1　 5組不同濃度BPA下線蟲的壽命

1μmol/L BPA濃度下線蟲的壽命與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。10μmol/L BPA濃度下線蟲的壽命與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。100μmol/L BPA濃度條件下，線蟲的壽命與對(duì)照組比較顯著延長(zhǎng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。100μmol/L BPA處理線蟲后，線蟲最長(zhǎng)生存時(shí)間由15 d延長(zhǎng)至17 d，中位生存時(shí)間由12 d延長(zhǎng)至13 d。1000μmol/LBPA濃度下線蟲的壽命與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖2　 BPA濃度為1μmol/L下線蟲的壽命

圖3　 BPA濃度為10μmol/L下線蟲的壽命

圖4　 BPA濃度為100μmol/L下線蟲的壽命

圖5　 BPA濃度為1000μmol/L下線蟲的壽命

3　討論

影響壽命的主要因素有環(huán)境因素（如空氣、水分、溫度）等，飲食因素、疾病因素、遺傳因素等［5-6］，而影響衰老的機(jī)制有免疫學(xué)說(shuō)、交聯(lián)學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)等。本研究利用模式生物秀麗隱桿線蟲來(lái)觀察BPA對(duì)其壽命的影響。

環(huán)境雌激素是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中的一大類，這類物質(zhì)進(jìn)人人和動(dòng)物體內(nèi)后可模擬細(xì)胞內(nèi)雌激素作用或改變?cè)摯萍に鼗钚?、干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，通過多種機(jī)制表現(xiàn)出擬天然雌激素或抗天然雄激素的作用，其結(jié)果可導(dǎo)致生殖功能障礙、生長(zhǎng)發(fā)育異常、出生缺陷、代謝紊亂和某些與激素有關(guān)疾病等［7-8］。作為環(huán)境雌激素的BPA，能導(dǎo)致生物體生殖細(xì)胞和染色體異常、生殖功能下降、生殖器腫瘤、免疫力降低等［9-11］。因此擴(kuò)大BPA對(duì)人類生殖系統(tǒng)以外的其它系統(tǒng)影響的研究尤為重要，進(jìn)而更全面地評(píng)價(jià)BPA對(duì)人類健康的影響。

已知人體血清中BPA濃度為0.39～15.9 ng/mL（1.71～69.65 nmol/L）［12］，線蟲能從環(huán)境中吸收1μmol/L的BPA到體內(nèi)的量為2×10-6（2μg/g）［13］，相對(duì)應(yīng)于人體血清BPA的含量，因此線蟲的給藥應(yīng)為0.86～34.9μmol/L。連續(xù)5 d使用罐頭食品導(dǎo)致的BPA攝取量可比正常人群的水平高1200%［14］。所以為涵蓋正常BPA攝取量和和意外高攝取量，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置BPA的實(shí)驗(yàn)濃度梯度為1、10、100、1000μmol/L。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)濃度下BPA不會(huì)使線蟲的壽命縮短，反之BPA 100μmol/L組中線蟲的壽命有所延長(zhǎng)，但與其他藥物延壽的作用比較［15-17］，本實(shí)驗(yàn)得到的延壽作用并不明顯。分析BPA的延壽作用的原因有以下幾種可能：①影響雌激素合成，降低生殖能力從而影響壽命；②抑制了氧自由基的產(chǎn)生，改變抗氧化系數(shù)；③通過作用于體內(nèi)的延壽通路，如抑制mTOR通路，IIS通路等［18］，發(fā)揮延壽作用。由于秀麗隱桿線蟲屬于模式生物，為得到進(jìn)一步更有意義的結(jié)果應(yīng)在哺乳動(dòng)物上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并應(yīng)用更多壽命相關(guān)指標(biāo)驗(yàn)證BPA對(duì)壽命的影響。

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Effect of bisphenol A on lifespan in Caenorhabditis elegans

SUN Tianqi CAO Zheng ZHANG Zhihua ZHANG Yan
Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Harbin 150081，China

Objective To study the effect of bisphenol A（BPA）on the lifespan in Caenorhabditis elegans（C.elegans）. M ethods Solid culture was used to evaluate the effect of 0（control group），1，10，100，1000μmol/L BPA on the lifespan in C.elegans（with 70 in each group）.Results 1，10，1000μmol/L BPA had no significant effect on the lifespan of C.elegans，compared with control group，the differences were not statistically significant（P＞0.05）.Compared with control group，100μmol/L BPA extended the lifespan of C.elegans（P＜0.05），the longest survival time from 15 d extended to 17 d，the median survival time from 12 d extended to 13 d.Conclusion 1，10，1000μmol/L BPA do not shorten the lifespan in C.elegans，100μmol/L BPA can extend the lifespan of C.elegans.

Bisphenol A；Environmental estrogens；Lifespan；C.elegans

Q75

A

1673-7210（2015）05（a）-0004-04

2014-12-14本文編輯：蘇暢）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81100072）。

孫天琪（1990.8-），女，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)專業(yè)2013級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：藥理學(xué)。

張妍（1973.6-）女，博士，教授；研究方向：心血管藥理學(xué)、新藥研發(fā)。