鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

酶解法提取銀耳多糖的工藝及穩(wěn)定性研究

鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

為了對(duì)銀耳多糖進(jìn)行深加工，本文優(yōu)化了酶解法提取銀耳多糖的提取條件。酶解法最高提取率為15.36%，回收率97.3%，精密度1.2%，最佳條件為：纖維素酶1.5%，纖維素酶0.5%，中性蛋白酶2.0%，溫度50℃，pH4.5，時(shí)間60 min。通過(guò)試驗(yàn)證明溫度、pH對(duì)多糖提取液影響極小，提取液具有良好的穩(wěn)定性。白砂糖對(duì)提取液有促進(jìn)作用，乳酸反之。酶解法是一種條件溫和、節(jié)約能耗、提取率高的提取方法。

銀耳；多糖；提取；影響因素

銀耳多糖是銀耳中的功能性成分，具有活性作用，無(wú)甜味，易溶于熱水［1］，且水溶液有旋光性，無(wú)變旋現(xiàn)象。銀耳多糖具有多種功能，如提高機(jī)體免疫力，抗腫瘤作用，降血糖、降血脂、降血壓作用，抗疲勞、抗衰老作用，抗病毒作用，抗氧化作用等。

近10多年來(lái)，許多學(xué)者圍繞食用菌的營(yíng)養(yǎng)成分、功能因子、保健功效等方面進(jìn)行了研究［2］。對(duì)于銀耳的種植、提取、純化等發(fā)面已有了部分研究，但銀耳功能成分多糖并未得到廣泛深入的研究，其利用開發(fā)也是少之又少。銀耳多糖擁有廣闊的市場(chǎng)，不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且還具有一定的醫(yī)療保健功能和巨大的藥用價(jià)值，其功能特性越來(lái)越受到關(guān)注，故而我們很有必要加大對(duì)銀耳多糖的開發(fā)利用，實(shí)現(xiàn)其商品價(jià)值［3］。

本文對(duì)水提法、堿提法、酶解法3種提取多糖的方法進(jìn)行比較，得出最佳提取方法是酶解法，并對(duì)影響酶解法提取多糖的影響因素進(jìn)行探討，得到提取的最佳條件。通過(guò)試驗(yàn)分析溫度、pH對(duì)多糖提取液的穩(wěn)定性影響，再分析不同添加量的白砂糖、乳酸對(duì)提取液黏度的影響。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1原料

銀耳：購(gòu)于淮安市蘇果超市。

1.1.2試劑

果膠酶；纖維素酶；中性蛋白酶；三氯乙酸；氫氧化鈉溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；白砂糖；乳酸；檸檬酸等。以上試劑購(gòu)自于南京化學(xué)試劑股份有限公司，均為分析純。

1.1.3儀器

IFM-100高速粉碎機(jī)：上海蒙特工業(yè)自動(dòng)化有限公司；R-201真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京中西泰安技術(shù)服務(wù)有限公司；UV2100型紫外可見分光光度計(jì)：上海儀托環(huán)保儀器有限公司；NDZ-79旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)：上海方瑞儀器有限公司；BSZ100自動(dòng)部分收集器：蘇州江東精密儀器有限公司；雷磁PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1熱水提取法

銀耳磨碎成粉按體積比1∶60加水，置于80℃水浴中恒溫提取4h，過(guò)濾，濾渣用相同方法水提2次，合并水提液。濃縮，加三氯乙酸除蛋白。離心，取上清液，定容。

1.2.2堿提取法

銀耳磨碎成粉按體積比1∶100加入1 mol/L氫氧化鈉溶液，置于80℃水浴中提取4 h，過(guò)濾，稀堿提取液經(jīng)中和、濃縮后，加三氯乙酸除蛋白，濃縮、定容。

1.2.3酶解提取法

銀耳磨碎成粉按體積比1∶80加水，調(diào)至pH6.6，加入1.5%的復(fù)合酶（中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），置于40℃水浴中恒溫酶促反應(yīng)4 h，迅速升溫至80℃滅酶，恒溫提取1 h，過(guò)濾，濾液濃縮后加入3倍體積95%乙醇靜置過(guò)夜。離心，棄上清液，沉淀加水溶解，三氯乙酸除蛋白，定容［4］。

通過(guò)對(duì)熱水提取法、堿提取法和酶堿提取法的比較，得出酶解提取法的提取效果最好，故而下面對(duì)酶解提取法的提取條件進(jìn)行探討。

1.2.4酶添加量對(duì)多糖提取率的影響

精密稱取銀耳粉2.0 g（6份），加入pH5.0的磷酸鹽緩沖液各20 mL，分別加入0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1%的復(fù)合酶（中性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶），在50℃下水浴70 min［5］，以多糖提取率為指標(biāo)，確定復(fù)合酶的最佳用量。

1.2.5pH對(duì)多糖提取率的影響

精密稱取銀耳粉2.0 g（6份），分別加入pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的磷酸鹽緩沖液20 mL，并加入1.2.4中最佳用量的復(fù)合酶，在50℃下水浴70 min［5］，以多糖提取率為指標(biāo)，確定多糖提取的最佳pH。

1.2.6溫度對(duì)多糖提取率的影響

精密稱取銀耳粉2.0 g（5份），加入1.2.5中最佳pH的磷酸和磷酸鈉緩沖液各20 mL，并加入1.2.4中最佳用量的復(fù)合酶，分別在10、30、50、70、90℃下水浴70 min［6］，以多糖提取率為指標(biāo)，確定多糖提取的最佳溫度。

1.2.7提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

精密稱取銀耳粉2.0 g（5份），加入pH5.0的檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液各20 mL，并加入1.2.4中最佳用量的復(fù)合酶，分別在2.2.6中的最佳溫度下分別水浴20、40、60、80、100 min，以多糖提取率為指標(biāo)，確定多糖提取的最佳時(shí)間［7］。

1.2.8復(fù)合酶配比的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以上述影響3種酶的最佳溫度、最佳pH和最佳提取時(shí)間，以不同質(zhì)量百分比的纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶的不同酶用量設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合酶的最佳配比。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　復(fù)合酶配比正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1The ratio of compound enzymes orthogonal experiment factor level table

1.2.9復(fù)合酶提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照最佳復(fù)合酶配比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入最佳配比的纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶，以提取溫度、提取時(shí)pH和提取時(shí)間為因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表2所示。

表2　復(fù)合酶提取因素正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2Compound enzyme extraction orthogonal experiment factors and levels of factors

1.2.10多糖提取液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將上述酶解提取法中的銀耳多糖提取液經(jīng)過(guò)精濾、濃縮、防腐制成銀耳多糖提取液成品，再討論溫度和pH對(duì)多糖提取液的影響。

溫度對(duì)多糖提取液穩(wěn)定性的影響：分別將銀耳多糖提取液放置于5℃條件下2個(gè)月，25℃條件下2個(gè)月，39℃條件下2個(gè)月，5℃和39℃每24小時(shí)交替一次（持續(xù)2個(gè)月），放置結(jié)束后恢復(fù)到溫度20℃時(shí)檢測(cè)銀耳多糖提取液的多糖質(zhì)量濃度、pH、吸光度（波長(zhǎng)400 nm）和黏度等理化指標(biāo)［8］，判斷其在不同溫度下的熱穩(wěn)定性，從而證明多糖產(chǎn)品能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

pH對(duì)多糖提取液穩(wěn)定性的影響：室溫下，通過(guò)加入檸檬酸溶液或NaOH溶液將銀耳多糖提取液的pH調(diào)節(jié)至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5分別檢測(cè)在各個(gè)pH條件下銀耳多糖提取液的多糖質(zhì)量濃度、吸光度（波長(zhǎng)400 nm）和黏度等理化指標(biāo)［9］，從而判斷其酸堿穩(wěn)定性。

1.2.11添加劑對(duì)銀耳提取液黏度的影響

在銀耳多糖產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，由于會(huì)添加白砂糖、乳酸，其加入可能會(huì)改變銀耳提取液的黏度，從而影響銀耳多糖產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，將白砂糖、乳酸對(duì)銀耳提取液的黏度影響進(jìn)行了試驗(yàn)［10］。

白砂糖添加量對(duì)多糖提取液黏度的影響：取5份1.2.10所述的銀耳多糖提取液成品，分別加入5、10、15、20、25 g白砂糖。樣品經(jīng)攪拌靜置后，在30℃下進(jìn)行測(cè)定，以銀耳多糖提取液的黏度作為指標(biāo)，從而判斷白砂糖對(duì)銀耳多糖提取液有何影響，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。

乳酸添加量對(duì)多糖提取液黏度的影響：取5份1.2.10所述的銀耳多糖提取液成品，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL乳酸。樣品經(jīng)攪拌靜置后進(jìn)行測(cè)定，以銀耳多糖提取液的黏度作為指標(biāo)，從而判斷乳酸對(duì)銀耳多糖提取液有何影響，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1水、堿、酶法提取多糖的比較

用熱水提取法、堿提取法、酶解提取法提取銀耳多糖，根據(jù)多糖的提取率、回收率、誤差絕對(duì)值、精密度，將三者進(jìn)行比較，結(jié)果見表3，并選出最優(yōu)方法。

表3　3種提取多糖方法的比較Table 3Comparison of three kinds of polysaccharides extraction method %

由表3可以看出，酶解法的提取率、回收率、精密度均高于水提法和堿提法，酶解法的誤差絕對(duì)值也略低于水提法和堿提法，即酶解法為最佳提取方法。國(guó)標(biāo)中回收率的范圍為87.8%～110.8%，精密度小于5.8%，酶解法符合國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，所以此方法可行。

另外，水提取的缺點(diǎn)是提取溫度高，耗時(shí)長(zhǎng)且效率低，成本高，安全性低，而堿提取易破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)及活性。酶解法具有條件溫和、易去除雜質(zhì)和節(jié)約能耗等優(yōu)點(diǎn)。

2.2酶添加量對(duì)多糖提取率的影響

由上述1.2.4的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，多糖的提取率逐漸增加，當(dāng)酶添加量為1.8%時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高，提取率為15.15%。

2.3pH對(duì)多糖提取率的影響

由上述1.2.5所述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖1　酶添加量對(duì)多糖提取率的影響Fig.1Effect of enzyme addition quantity on the rate of extraction of polysaccharide

圖2　pH對(duì)多糖提取率的影響Fig.2Effect of pH on the rate of extraction of polysaccharide

由圖2可知，隨著pH得升高，多糖的提取率也升高，在pH為4.5時(shí)提取率略有下降趨勢(shì)，pH為4.5時(shí)，多糖提取率最高，提取率為15.13%。

2.4溫度對(duì)多糖提取率的影響

由上述1.2.6的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3Effect of temperature on the rate of extraction of polysaccharide

由圖3可知，溫度對(duì)多糖提取率的影響呈拋物線形，溫度對(duì)多糖提取率的影響較大，當(dāng)溫度達(dá)50℃時(shí)提取率最高，提取率為15.16%。

2.5提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由上述1.2.7的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在提取時(shí)間大于40 min后，時(shí)間對(duì)多糖提取率影響呈直線趨勢(shì)，提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響不大，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，提取率達(dá)到最高，提取率為14.98%。

2.6酶法提取多糖的正交試驗(yàn)

圖4　提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.4Effects of extraction time on yield of polysaccharide extraction

根據(jù)單因素對(duì)多糖得率的影響，考慮到不同因素和酶共同作用會(huì)影響多糖提取率，因此設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合酶的最佳配比和最佳反應(yīng)條件。

2.6.1復(fù)合酶酶量配比正交試驗(yàn)

采用三因素三水平的正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶最佳配比，分9組實(shí)驗(yàn)，分別選擇不同質(zhì)量百分比的纖維素酶、果膠酶和中性蛋白酶的酶用量進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4　復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 4Analysis of orthogonal experimental results of composite enzyme

如表4所示，從極差分析結(jié)果來(lái)看，影響酶解提取法的各個(gè)因素的優(yōu)先順序?yàn)镃＞A＞B，最佳條件應(yīng)為A2B1C3，即纖維素酶添加量為1.5%，果膠酶添加量為0.5%，中性蛋白酶添加量為2.0%，銀耳多糖的提取率為15.17%。

2.6.2復(fù)合酶提取工藝正交試驗(yàn)

確定了復(fù)合酶的最佳配比，再考慮提取溫度、提取pH值和提取時(shí)間對(duì)銀耳多糖提取率的影響，針對(duì)這些因素，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)確定反應(yīng)的最佳條件。分9組實(shí)驗(yàn)，加入最佳配比的復(fù)合酶，分別在不同的溫度、pH、時(shí)間條件下進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5　復(fù)合酶提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 5Results of orthogonal experiment of compound enzyme extraction process analysis

如表5所示，從極差分析結(jié)果來(lái)看，影響酶解提取法的各個(gè)因素的優(yōu)先順序?yàn)锳＞B＞C，最佳條件應(yīng)為A2B2C2，即提取溫度為50℃，pH為4.5，提取時(shí)間為60 min，銀耳多糖的提取率為15.36%。

2.7多糖提取液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.7.1溫度對(duì)提取液穩(wěn)定性的影響

對(duì)上所述的銀耳多糖的提取液進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)試，調(diào)至不同溫度，測(cè)試其中pH、多糖質(zhì)量濃度、吸光度（波長(zhǎng)400 nm）和黏度，結(jié)果如表6所示。

表6　溫度對(duì)提取液穩(wěn)定性的影響Table 6Effect of temperature on the stability of the extract

從表6可以看出，溫度對(duì)銀耳多糖提取液的pH值、多糖質(zhì)量濃度、吸光度和黏度影響都比較小。綜合測(cè)試的各項(xiàng)指標(biāo)可知，銀耳多糖提取液在很大的溫度范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的，所以銀耳多糖產(chǎn)品可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存而不變質(zhì)。

2.7.2pH對(duì)提取液穩(wěn)定性的影響

對(duì)上所述的銀耳多糖提取液進(jìn)行酸堿穩(wěn)定性測(cè)試，調(diào)至不同pH，測(cè)試其中多糖質(zhì)量濃度、吸光度（波長(zhǎng)400 nm）、流動(dòng)性和黏度，結(jié)果如表7所示。

表7　pH對(duì)多糖提取液穩(wěn)定性的影響Table 7Effect of pH on the stability of the solution of polysaccharide extraction

從表7可以看出，在pH范圍為4.5～10.5時(shí)，銀耳多糖提取液的多糖質(zhì)量濃度和流動(dòng)性都未受到pH變化的影響，吸光度和黏度變化也比較小，所以綜合測(cè)試的各項(xiàng)指標(biāo)可證明，銀耳多糖的提取液在pH為4.5～10.5范圍內(nèi)具有良好的酸堿穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于各類pH范圍的產(chǎn)品中，應(yīng)用范圍較為廣泛。

2.8添加劑對(duì)多糖提取液黏度的影響

2.8.1白砂糖添加量對(duì)多糖提取液黏度的影響

向銀耳多糖提取液加入不同量的白砂糖，測(cè)定其對(duì)提取液黏度的影響，結(jié)果如表8所示。

表8　白砂糖增加量對(duì)提取液黏度的影響Table 8Effect of sugar increase to extract viscosity

從表8可以看出，隨著白砂糖添加量的增加，提取液黏度呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明白砂糖并不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生不利影響，反而起到了促進(jìn)作用。在銀耳的多糖產(chǎn)品中可根據(jù)產(chǎn)品的口感要求添加適量的白砂糖。

2.8.2乳酸添加量對(duì)多糖提取液黏度的影響

向銀耳多糖提取液加入不同量的乳酸，測(cè)定其對(duì)提取液黏度的影響，結(jié)果如表9所示。

表9　乳酸增加量對(duì)黏度的影響Table 9Effect of lactic acid on the viscosity increase

從表9可以看出，隨著乳酸添加量的增加，多糖提取液黏度呈下降趨勢(shì)，對(duì)其造成不利影響。所以在銀耳的多糖產(chǎn)品加工過(guò)程中，為保證乳酸的添加不影響產(chǎn)品的質(zhì)量，乳酸的添加量偏小比較好。

3結(jié)論

銀耳多糖的3種提取方法中，熱水提取法提取率最低，堿提取法提取法提取率較高，酶解提取法提取率最高，絕對(duì)誤差值最小，酶解法提取率為12.1%，回收率為97.3%，精密度為1.2%，綜上所述銀耳多糖提取的3種方法中酶解提取法為最佳方法。再對(duì)酶解提取法的影響因素進(jìn)行探討，得出酶解法的最佳提取條件為：纖維素酶添加量為1.5%，纖維素酶添加量為0.5%，中性蛋白酶添加量為2.0%，反應(yīng)溫度為50℃，pH為4.5，反應(yīng)時(shí)間為60 min，銀耳多糖的最高提取率為15.36%。通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明溫度和pH對(duì)銀耳多糖的提取液的影響極小，可忽略不計(jì)，從而說(shuō)明銀耳多糖的提取液具有良好的穩(wěn)定性，可以廣泛應(yīng)用于各類pH范圍的銀耳多糖產(chǎn)品中，并能保證產(chǎn)品在長(zhǎng)期存放過(guò)程中的穩(wěn)定性。白砂糖對(duì)銀耳多糖的提取液黏度有提升作用，白砂糖的增加不影響銀耳多糖提取液的質(zhì)量，在銀耳多糖的產(chǎn)品中可根據(jù)產(chǎn)品口感的要求向產(chǎn)品中加入適量的白砂糖。乳酸添加會(huì)降低提取液的黏度，影響銀耳多糖提取液的質(zhì)量，在銀耳多糖的產(chǎn)品中要少加入乳酸以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)為建立方便、高效的多糖提取途徑提供了參考，為銀耳多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。

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Study on Extraction Technology and Stability of Tremella Polysaccharide by Enzymatic Hydrolysis

BAO Hui-mei
（Jiangsu food and drug of Career Technical College College of food science and Nutritional Engineering Huai'an 223003，Jiangsu，China）

To deep processing of tremella polysaccharide.In this paper，enzymatic hydrolysis extraction of tremella polysaccharide extraction condition was optimized.Enzymatic hydrolysis the highest extraction rate was 15.36%，the recovery rate of 97.3%，the precision of 1.2%，the best conditions for：cellulase 1.5%，0.5% cellulase and 2.0%acid protease，temperature 50℃，pH4.5，time for 60 min.Through experiment that the temperature and pH on the polysaccharide extract，extract has a good stability.Sugar has promoting effect to the extract，lactic acid and vice.Enzymatic hydrolysis.is a kind of mild conditions，the extraction methods of saving energy consumption，high extraction yield.

tremella；polysaccharides；extraction；impact

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.004

2013-12-03

鮑會(huì)梅（1974—），女（漢），副教授，碩士，主要從事食品理化檢驗(yàn)技術(shù)教學(xué)工作。