王 娟，張銘霞，曹雁平，楊貞耐，王 蓓，，*

（1.北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.北京工商大學(xué)，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京100048；3.北京工商大學(xué)，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京100048）

DNA指紋圖譜技術(shù)在奶酪發(fā)酵菌群中的應(yīng)用研究

王 娟1，張銘霞2，曹雁平1，楊貞耐3，王 蓓1，2，*

（1.北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.北京工商大學(xué)，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京100048；3.北京工商大學(xué)，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京100048）

DNA指紋圖譜技術(shù)是近年來較為常用的分子生物學(xué)技術(shù)，由于發(fā)酵菌群的DNA指紋圖譜直接反映DNA水平上的差異，因而作為微生物指紋圖譜的一個組成部分，DNA指紋圖譜這一現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在微生物研究中有其獨特的作用，這種技術(shù)在發(fā)酵菌群的鑒定、遺傳育種及多樣性等研究領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。常用于發(fā)酵菌群研究的DNA指紋圖譜技術(shù)有RFLP、T-RFLP、SSCP、RAPD、DGGE、AFLP等。本論文在綜合介紹DNA指紋圖譜的一般常用技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合近年來國內(nèi)外奶酪發(fā)酵菌群中DNA指紋圖譜技術(shù)研究現(xiàn)狀，在探討其在奶酪發(fā)酵菌群相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)上，逐一介紹了各種技術(shù)的原理、優(yōu)缺點及研究現(xiàn)狀，對我國傳統(tǒng)奶酪發(fā)酵菌群的研究具有重要的實際意義與理論價值。

DNA指紋圖譜，傳統(tǒng)奶酪，發(fā)酵菌群，分子生物學(xué)

DNA指紋圖譜技術(shù)是通過物質(zhì)在DNA水平上的差異，以現(xiàn)代分子生物學(xué)方法來標(biāo)記，同時構(gòu)建DNA指紋圖的一種技術(shù)。由于同種微生物的核苷酸序列具有相對穩(wěn)定性，而不同種類微生物核苷酸序列具有一定差異性，因而可以通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建體系微生物DNA指紋圖譜的方法，達到對微生物菌群多樣性的研究。DNA指紋圖譜技術(shù)已成功地應(yīng)用于許多領(lǐng)域中，如發(fā)酵食品中的微生物群落分析研究［1］，樣品原料或中間產(chǎn)物中微生物群落的多樣性分析等［2］。

傳統(tǒng)奶酪中發(fā)酵菌群豐富又復(fù)雜，對奶酪的風(fēng)味和流變學(xué)性質(zhì)有重要的影響。因而近年來奶酪發(fā)酵過程中微生物多樣性及其對奶酪感官品質(zhì)的影響的相關(guān)研究越來越為人們所關(guān)注。人們采用不同的DNA指紋圖譜技術(shù)對奶酪中的發(fā)酵菌群進行系統(tǒng)研究，常用的DNA指紋圖譜技術(shù)有限制性片段長度多態(tài)性、末端限制性片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)、擴增片段長度多態(tài)性、分子雜交技術(shù)等，本文擬從這些方法的基本原理及其在奶酪微生物多樣性相關(guān)分析應(yīng)用等方面進行闡述。

1 限制性片斷長度多態(tài)性

限制性片斷長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），又稱為核糖體DNA擴增片段限制性內(nèi)切酶分析（amp lified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA），該技術(shù)是通過DNA的多態(tài)性來研究微生物群落多樣性的方法。RFLP技術(shù)主要是基于PCR技術(shù)擴增目的基因序列，然后選擇特異限制性內(nèi)切酶將擴增的目的基因序列切割成大小不同的DNA片斷，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析這些片段，從而獲得待測樣品中微生物群個體差異信息，以達到對樣品中菌群分析并鑒定的目的。RFLP方法適用于比較分析不同樣品或是樣品在不同時期微生物菌落結(jié)構(gòu)的變化，尤其適用于大批量樣品的分類、鑒定研究［3］，由于該方法操作簡單，因而在奶酪微生物菌群研究中仍被廣泛使用。Dariush等對伊朗游牧部落Motal奶酪的益生菌群落結(jié)構(gòu)進行了PCR-RFLP技術(shù)分析，并在此技術(shù)基礎(chǔ)上確定得到Motal奶酪中益生菌的主要類型是嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌［4］。

RFLP技術(shù)雖然簡單，但由于基因組信息較大，酶切圖譜條帶過于復(fù)雜，因而存在評價結(jié)果準(zhǔn)確度相對較低的問題。因此近年來在RFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了兩種新技術(shù)，分別是末端限制性片斷長度多態(tài)性（term inal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技術(shù)和tRNAAla-23S rDNA限制性片斷長度多態(tài)性（tRNAAla-23S ribosomal DNA Restriction Fragment Length Polymorphism，tRNAAla-23S rDNA-RFLP）技術(shù)。

T-RFLP與RFLP技術(shù)主要的區(qū)別是在T-RFLP中，一個引物的5'末端用熒光物質(zhì)來標(biāo)記，因而檢測得到的為帶有熒光標(biāo)記的末端片斷［5］，該步驟極大地簡化了圖譜帶型，使得T-RFLP技術(shù)更易于進行復(fù)雜菌落結(jié)構(gòu)分析并獲得發(fā)酵菌群多樣性的更多信息，同時該技術(shù)也可通過圖譜條帶來評價微生物的豐度、均度，以及樣品間的相似性，因而得到的信息更加準(zhǔn)確［6］。Rossetti等［7］在對奶酪微生物種群（乳酸菌，檸檬串珠菌株等）研究過程中，同時對比了以逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP技術(shù)進行的半定量分析結(jié)果和利用菌株表型鑒定以及生理生化實驗進行的傳統(tǒng)培養(yǎng)所得到的分析結(jié)果，對比結(jié)果表明T-RFLP技術(shù)可以對奶酪發(fā)酵過程中菌群的細微變化進行檢測，并且重復(fù)性較好，而傳統(tǒng)的菌落計數(shù)法靈敏度較低，對菌群的細微變化無法檢測。此外，雖然和傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)相比T-RFLP技術(shù)具有快捷、靈敏度高的特點，但T-RFLP技術(shù)的使用范圍仍具有一定限制，尤其對復(fù)雜環(huán)境內(nèi)的樣品而言，由于在該環(huán)境下不同的微生物在酶切后可能會產(chǎn)生相同的切割片斷，因而易對樣品中微生物的種類與含量作出錯誤估計，導(dǎo)致結(jié)果的不確定性［3］。

圖1 tRNAAla-23S rDNA-RFLP技術(shù)的具體流程Fig.1 tRNAAla-23S rDNA-RFLPworkflow

tRNAAla-23S rDNA-RFLP技術(shù)是將16S-23S rDNA基因間區(qū)（Intergenic Spacer Region，ISR）分析技術(shù)與RFLP技術(shù)聯(lián)合的一種新方法。該方法是利用轉(zhuǎn)錄核糖體30S小亞基的16S rDNA和50S大亞基的23S rDNA的保守區(qū)段與基因間區(qū)（ISR）來分析樣品中發(fā)酵菌群系統(tǒng)發(fā)育情況，并對菌群進行分類和鑒定的重要方法。其中由于16S-23S rDNA的序列具有長度和序列的可變性，變異的程度比16S rDNA和23S rDNA要大，因而能夠得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。該方法的操作流程如圖1所示：同時采用兩個特異引物：tRNAAla（由酒類酒球菌的tDNAAla的一個保守的序列進行設(shè)計）與23S/p10（位于大腸桿菌中23S rRNA基因的456～474），利用PCR技術(shù)，對基因區(qū)間序列進行擴增，擴增產(chǎn)物再用限制性內(nèi)切酶（HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ）進行酶切，最后酶切產(chǎn)物用聚丙烯酞胺凝膠電泳，觀察酶切片段的多態(tài)性，統(tǒng)計分析電泳圖譜，即可得到待測樣品中不同菌株的遺傳相似水平，還可以用于鑒定樣品中發(fā)酵菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Mancini等［8］同時運用tRNAAla-23S rDNA-RFLP技術(shù)與其他兩種DNA指紋圖譜技術(shù)，即隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）和重復(fù)基因外回文序列分析技術(shù)（repetitive extragenic palindrom ic-PCR，rep-PCR），對Grana Padano奶酪成熟過程中分離得到的典型乳酸菌種間和種內(nèi)的多樣性進行研究，分析結(jié)果表明，tRNAAla-23S rDNA-RFLP技術(shù)的重現(xiàn)性要高于RAPD和rep-PCR技術(shù)，并且靶tRNAAla-23S rDNA序列在細菌鑒定應(yīng)用中可獲得更加準(zhǔn)確及有價值的信息，從而能夠更好地對奶酪中乳酸菌在種屬水平進行進一步的分析與鑒定。

2 逆轉(zhuǎn)錄變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳技術(shù)（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是一種快速、經(jīng)濟、可靠、重復(fù)性好的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠同時實現(xiàn)多個樣品的分析。該技術(shù)能較為客觀與直觀地鑒定及分析微生物，因而被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一［9-10］，也常用于檢測奶酪發(fā)酵過程中微生物菌落變化［11］。該技術(shù)的主要原理是：在變性梯度聚丙酰胺凝膠電泳中，長度相同但序列不同的DNA分子會在變性劑（尿素、甲酰胺）的作用下產(chǎn)生不同的解鏈行為，在外加電場的作用下會在凝膠中形成不同的遷移位置，從而使DNA片斷得到分離。電泳結(jié)束后，經(jīng)過染色即可觀察圖譜中分開的不同帶型。雖然DGGE技術(shù)已廣泛用于多種食品發(fā)酵過程中菌群研究，然而同其他基于PCR的分子生物技術(shù)一樣，DGGE技術(shù)除了會受到PCR擴增時產(chǎn)生偏差的影響外，也具有一定的自身局限性。例如，DGGE適于分離200～500bp的目的基因片斷，超出此范圍的片斷則難以分析，因此所得序列僅能提供較為有限的系統(tǒng)發(fā)育信息。其次，研究表明DGGE僅能檢測到發(fā)酵乳制品中微生物含量達到1%～2%以上的優(yōu)勢菌種，而弱勢菌種一般不易被檢測到［12］，因而會造成對樣品中某些發(fā)酵菌群多樣性的低估或者高估。

由于受到傳統(tǒng)加工技術(shù)與地域的影響，奶酪中的微生物具有獨特性，并且不同微生物群體在發(fā)酵過程的不同階段活躍程度不同，因而為了更好地揭示手工奶酪的微生物代謝活性，一些研究者利用RT-RNA技術(shù)對奶酪中發(fā)酵菌株的多樣性進行進一步分析。通過結(jié)合RT-PCR-DGGE（基于RNA）和PCRDGGE（基于DNA），從奶酪總體微生物（DNA衍生的）中區(qū)分代謝活性較強（RNA衍生的）的微生物，從而更好地研究奶酪發(fā)酵過程中微生物菌群變化。Randazzo等［13］對手工Sicilian奶酪成熟過程中發(fā)酵菌群的DNA衍生的DGGE圖譜與RNA衍生的DGGE圖譜進行比較，表明了該奶酪在不同發(fā)酵階段微生物群體具有不同的代謝活性。已有研究結(jié)果表明RTPCR-DGGE方法對發(fā)酵時間較長的奶酪中菌群變化的相關(guān)研究非常有效［14］，并且由于RNA的穩(wěn)定性相對于DNA而言較差，RNA會在已死亡的微生物中迅速地降解，因此基于RNA的測定比基于DNA的測定法更為敏感。為了獲得Fontina PDO奶酪在發(fā)酵過程中細菌群落的變化以及該奶酪中的特征微生物菌群更加詳細的信息，Dolci等［15］將PCR-DGGE和RTPCR-DGGE技術(shù)同時應(yīng)用于Fontina PDO奶酪的表面，亞表層以及奶酪內(nèi)部。研究結(jié)果表明：RT-PCRDGGE分析方法得到的電泳條帶更為豐富，因而基于RNA的RT-PCR-DGGE技術(shù)能夠給出奶酪在發(fā)酵過程中微生物多樣性的更詳細信息。

3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）技術(shù)是近年來隨著對人類基因組進一步深入研究而發(fā)展起來的一種與PCR技術(shù)相結(jié)合，利用電泳方法分離構(gòu)象不同的DNA序列，從而檢測和分析堿基突變的一種分子生物學(xué)技術(shù)。由于單鏈DNA自身核苷酸序列以及物理化學(xué)環(huán)境折疊成的三級結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致其在非變性凝膠中的電泳遷移率存在差異，因而利用此點可以對DNA單鏈中基因突變進行檢測和分析。

這項技術(shù)是由Orita等［16］建立的，最初用來檢測已知或未知的DNA多態(tài)性或基因的點突變，目前已成為繼PCR-DGGE后，研究手工奶酪中復(fù)雜的微生物發(fā)酵菌群最常用的分析方法。當(dāng)前大量研究表明SSCP方法操作簡單快捷、靈敏度高，但對實驗條件（電泳條件）要求相對較嚴(yán)格。Callon等［17］結(jié)合SSCP技術(shù)與PCR技術(shù)對3種已注冊產(chǎn)地標(biāo)記（Registered Designation of Origin，RDO）的傳統(tǒng)Salers奶酪中的酵母菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的對比表明SSCP技術(shù)分析得到的菌群結(jié)果準(zhǔn)確度高，即該技術(shù)能夠快速分析奶酪在制作和成熟階段中的酵母菌群落的演替過程。

Retureau等［18］將培養(yǎng)基平板計數(shù)與SSCP技術(shù)相結(jié)合確定奶酪發(fā)酵過程中微生物多樣性，并以此為指標(biāo)對Saint-Nectaire鮮乳奶酪的微生物安全性進行檢測，檢測結(jié)果表明命名為TR15的天然混合菌體與分離于Saint-Nectaire鮮乳奶酪表面的菌株在奶酪發(fā)酵過程中微生物多樣性變化有所不同，并且TR15對李斯特菌的抗性較強，能夠顯著地抑制該菌在奶酪表面生長。平板培養(yǎng)結(jié)果和SSCP分析結(jié)果均表明由TR15混合菌株制得的奶酪中含有較高水平的乳桿菌和明串珠菌，同時SSCP分析結(jié)果還顯示TR15奶酪中同時含有疏松肉桿菌（Carnobacterium mobile），阿氏節(jié)桿菌（Arthrobacter arilaitensis）等菌株，這些菌株也能夠有效的對李斯特菌進行抑制，因此該研究表明SSCP技術(shù)可以更好地對抑制食品中致病菌株生長的微生物的交互作用進行研究，同時對于闡明奶酪中微生物相互作用關(guān)系具有重要意義。

4 隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)

隨機擴增多態(tài)性DNA（random amp lified polymorphism DNA，RAPD）標(biāo)記技術(shù)是1990年由W illiams［19］和Welsh［20］同時發(fā)展起來的一種分類鑒定技術(shù)。RAPD的基本原理是根據(jù)不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點和數(shù)目可能不同，用一組人為設(shè)計的核苷酸作為引物，通過PCR隨機擴增得到該生物種特異性的DNA圖譜。該技術(shù)可用于細菌種間、亞種間的親緣關(guān)系分析，還可以用于未知菌株的快速測定等。當(dāng)前研究結(jié)果表明RAPD技術(shù)的優(yōu)點是簡單便捷，在不了解基因組DNA的任何序列信息的情況下就可以進行鑒定，但缺點是重復(fù)性差，鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，很難在種以及亞種的水平上準(zhǔn)確鑒定。

楊吉霞等［21］探討了RAPD技術(shù)對不同地區(qū)牦牛奶酪乳酸菌分類鑒定中的應(yīng)用，結(jié)果表明該技術(shù)能夠簡單快速的實現(xiàn)對發(fā)酵奶酪中的乳酸菌種間和種內(nèi)的區(qū)分，并且該研究結(jié)果還表明鑒定得到的39株菌株的RAPD圖譜的聚類表現(xiàn)出一定的地域性，即西藏與云南的地理位置相鄰，菌株較多聚在一起，而新疆的地理位置較遠，菌株很少與其余兩地的菌株聚為一組，該結(jié)論很好地證明了RAPD技術(shù)可用于不同地域菌株間的遺傳親緣關(guān)系研究。Ruiz等［22］使用三種分子技術(shù)，即隨機擴增多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)（RAPDPCR）、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC-PCR）和聚三核苷酸（polytrinucleotide（GTG）5-PCR）等，對分離于山羊奶酪和Manchego奶酪中的乳酸菌和參考菌株進行分析，從而比較這些技術(shù)對細菌的鑒定能力。結(jié)果表明，RAPD-PCR方法得到的電泳結(jié)果中的條帶數(shù)量最多，因而其能夠?qū)?fù)雜微生物體系中同種屬的菌株進行更好的歸類，而ERIC-PCR和（GTG）5-PCR方法則對某些不同種屬的菌株鑒定的結(jié)果顯示沒有差異性，因而RAPD-PCR方法具有較好的分辨能力，可用于對奶酪中不同種屬的乳酸菌菌株種屬分型鑒定。

5 擴增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)

擴增片段長度多態(tài)性分析（amp lified fragment length polymorphism，AFLP）是在RFLP技術(shù)與PCR相結(jié)合的基礎(chǔ)上衍生出來的一種新技術(shù)，其基本原理是先通過限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA產(chǎn)生不同大小的限制性片段，再使雙鏈人工接頭與酶切片段相連接，作為擴增反應(yīng)的模板DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預(yù)擴增，最后在接頭互補鏈的基礎(chǔ)上添加1～3個選擇性核苷酸作引物，對模板DNA基因再進行選擇性擴增，最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得DNA擴增片段，并根據(jù)擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。

AFLP與其他DNA指紋技術(shù)有相似之處，也有其獨特的優(yōu)點［23］：可用于各種大小不同基因組的指紋分析；具有一定靈活性，可通過特異性PCR引物設(shè)計和內(nèi)切酶組合的選擇，來調(diào)整AFLP指紋圖譜中限制性片段的適宜數(shù)目；采用嚴(yán)格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳，重復(fù)性好，分辨率高；操作簡單，可作為連接遺傳圖譜與物理圖譜間的橋梁，用于微生物基因組的分析研究。

AFLP技術(shù)建立初期用于植物育種的研究，后來發(fā)展成為可以分析任何來源DNA指紋圖譜的一項通用技術(shù)，近些年來被廣泛應(yīng)用于奶酪相關(guān)發(fā)酵菌群的分類鑒定。嗜熱鏈球菌是牛奶發(fā)酵過程中常用的發(fā)酵劑，Lazzi等［24］分別利用AFLP和RAPD對嗜熱鏈球菌的遺傳多樣性進行比較分析，研究數(shù)據(jù)表明和RAPD方法相比，AFLP為嗜熱鏈球菌的多樣性研究提供了更為精密的檢測結(jié)果，因而該技術(shù)對不同種的微生物識別效果更好。此外，近幾年來AFLP技術(shù)在奶酪發(fā)酵過程中菌體代謝通量相關(guān)研究領(lǐng)域也取得較大進展。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是屬于非發(fā)酵劑乳酸菌，其對大多數(shù)奶酪成熟過程中風(fēng)味的形成有重要作用。Lazzi等［25］根據(jù)互補DNA的擴增片段長度多態(tài)性（cDNA-AFLP）和實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qPCR）方法對鼠李糖乳桿菌PR1019在CB（cheese-like medium，CB）培養(yǎng)基中生長代謝的相關(guān)分子機制進行進一步研究，并取得了較好結(jié)果。

6 分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)（nucleic acid hybridization，NAH）是細菌分子生態(tài)學(xué)中利用特異探針來進行定性和定量分析微生物的一個重要工具，可以通過萃取樣品中得到的DNA或RNA，或者是原位雜交來進行［26］。一般來說，核酸雜交技術(shù)都是根據(jù)已知序列來設(shè)計的特異的寡核苷酸探針，然后用熒光或放射性元素對該探針進行標(biāo)記，并通過堿基互補的原則與目的基因進行雜交，最后利用檢測得到的雜交信號對發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析的方法。分子雜交法自身也存在一定的局限性，它一般對目的片斷（如優(yōu)勢菌種）檢測靈敏，但是由于其原理是根據(jù)已知基因設(shè)計探針，因而較難發(fā)現(xiàn)新的基因類型。

當(dāng)前在發(fā)酵菌群多樣性分析中應(yīng)用較多的分子雜交技術(shù)是數(shù)量斑點印跡雜交和原位雜交，它們的特點是不需要對目的片斷進行PCR擴增，因而可避免在PCR擴增中造成的誤差。此方法簡便快速，主要應(yīng)用于快速檢測。Ercolini等［27］對Stilton奶酪進行16S rRNA基因熒光原位雜交，并對其中的細菌進行觀察檢測，觀察到了大量的菌落細胞均勻分布在奶酪基質(zhì)中，因而該技術(shù)在研究食品中微生物群體空間分布，尤其是那些質(zhì)地較脆弱不易進行檢測操作的食品基質(zhì)中具有良好的應(yīng)用前景。Babot等［28］針對Gruyère奶酪中丙酸桿菌（propionibacteria）的16S rRNA基因來設(shè)計寡核苷酸探針，并優(yōu)化熒光原位雜交對該類細菌數(shù)目進行檢測，結(jié)果表明和平板計數(shù)法相比，該方法能夠快速有效地檢測奶酪樣品中的丙酸桿菌含量，再次驗證分子雜交技術(shù)可以對奶酪中的一些細菌達到快速檢測的效果。

7 展望

奶酪中含有豐富的發(fā)酵菌群，其對奶酪的風(fēng)味及流變學(xué)性質(zhì)具有重要影響，因此奶酪發(fā)酵菌群的多樣性研究是傳統(tǒng)奶酪工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。相對于繁瑣的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法而言，應(yīng)用DNA指紋圖譜技術(shù)分析，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡便地對發(fā)酵菌群進行分類、鑒定和分析，在近年來的研究中已經(jīng)展現(xiàn)出了巨大的優(yōu)越性，已成為研究奶酪以及其他食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的有效工具。不過每種方法都有其自身的優(yōu)勢與不足，雖然利用不同分子生物學(xué)技術(shù)可以獲得更加真實的微生物群落多樣性，彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，但要得到奶酪發(fā)酵過程中的主要發(fā)酵菌群則仍需要通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法。因此，用分子技術(shù)指導(dǎo)傳統(tǒng)培養(yǎng)的方向，用傳統(tǒng)培養(yǎng)的結(jié)果對分子方法進行驗證，二者互為補充，已經(jīng)成為研究奶酪以及其他發(fā)酵食品中微生物多樣性的新方向。

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The application research of DNA fingerprinting technology in the bacterial fermentation microflora of cheese

WANG Juan1，ZHANG M ing-xia2，CAO Yan-ping1，YANG Zhen-nai3，WANG Bei1，2，*
（1.Beijing Engineering and Technology Research Centre of Food Additives，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China；2.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China；3.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China）

In recent years DNA fingerprinting technique was more and more popular in molecular biologyresearching. The DNA fingerprinting of bacterial fermentation microflora could directly reflect their differenceson the DNA level. As a necessary part of the microbial fingerprinting，DNA fingerprinting of the modernmolecular biology techniques had played an important role on the microbiological studies，and as well as in thefield of identification，and genetic diversity researching of fermentation microflora. Usually DNA fingerprintingtechniques such as RFLP，T-RFLP，SSCP，RAPD，DGGE，AFLP and so on have been applied in most fermentationmicroflora studies. Based on introduction of the common techniques of DNA fingerprinting technique anddiscussion of the application of DNA fingerprinting on the fermentation micoflora of cheese，the paper hadcombined the current situation of DNA fingerprinting on cheese，and introduced the principle，advantages anddisadvantages，current researching situation of DNA fingerprinting techniques. And all of these discussions hadimportant the practical significance and theoretical value to study the fermentation microflora of our traditionalcheese.

DNA fingerprinting；traditional cheese；fermentation microflora；molecular biology

TS252.1

A

1002-0306（2015）08-0395-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.074

2014－12－05

王娟（1989-），女，碩士研究生，研究方向：乳制品風(fēng)味。

*通訊作者：王蓓（1981-），女，博士，副教授，研究方向：乳制品呈味肽分析。

國家自然基金青年基金資助項目（31201392）；國家“863”計劃項目（2011AA100903）；北京市教委科研計劃資助項目（KM201310011004）；北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團隊建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目（IDHT20130506）。